本文關鍵詞：microRNA在氧醚復合保護膿毒癥效應機制中的作用

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【摘要】：Sepsis(膿毒癥)是一種因為感染而導致的一系列病理、生理方面的異常,是導致全世界感染患者致死致殘的重要因素,一直是醫(yī)學界關注的焦點。我們的前期研究證實:(1)0.5MAC異氟醚復合60%氧對膿毒癥具有保護效應;(2)通過芯片研究,我們篩選確定了4個膿毒癥相關的miRNA:CLP可誘導小鼠外周血白細胞mi R-133a-3p、mi R-141-3p、mi R-3074-2-3p和mi R-542-3p的高表達,給予0.5MAC異氟醚復合60%氧治療可逆轉這4個miRNA的高表達。但這4個miRNA在中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞等的表達情況尚不清楚;目前公認的是,巨噬細胞在膿毒癥病理生理機制中起關鍵作用。我們預實驗結果表明,LPS刺激可誘導mi R-133a-3p、mi R-141-3p、mi R-3074-2-3p和mi R-542-3p在RAW264.7細胞中的表達顯著升高。本研究擬探討mi R-133a-3p、mi R-141-3p、mi R-3074-2-3p和mi R-542-3p在氧醚復合治療膿毒癥效應機制中的作用,并探討這些miRNA成為治療膿毒癥新靶點的可能。材料與方法1.miRNA通過NF-κB信號通路參與氧醚復合保護膿毒癥效應(1)細胞實驗:將RAW264.7巨噬細胞,隨機分為10組:Vehicle組、LPS組、Vehicle+0.5MAC ISO+60%Oxy組、LPS+0.5MAC ISO+60%Oxy組、LPS+LV-/mimic-/antigomo-mi R-133a-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy組、LPS+LV-/mimic-/antigomo-mi R-141-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy組、LPS+LV-/mimic-/antigomo-mi R-3074-2-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy組、LPS+LV-/mimic-/antigomo-mi R-542-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy組、LPS+LV-/mimic-/antigomo-mi R-mix+0.5MAC ISO+60%Oxy組和LPS+LV-/mimic-/antigomo-NC+0.5MAC ISO+60%Oxy組。用攜帶LV3-mmu-mi R-133a-3p、LV3-mmu-mi R-141-3p、LV3-mmu-mi R-3074-2-3p和LV3-mmu-mi R-542-3p質粒的慢病毒感染RAW264.7細胞72 h后,或者轉染mi R-133a-3p mimic/antigomo、mi R-141-3p mimic/antigomo、mi R-3074-2-3p mimic/antigomo和mi R-542-3p mimic/antigomo于RAW264.7細胞12 h后,給予細胞100ng/ml LPS刺激至少2小時建立細胞膿毒癥模型。氧醚治療:給予LPS刺激后即刻將細胞置于0.5MAC異氟醚復合60%氧氣環(huán)境處理2 h。收集細胞培養(yǎng)上清液檢測炎癥因子TNF-α和IL-1β水平;免疫印跡法檢測細胞核蛋白、細胞漿蛋白p65表達情況和全蛋白p-p65、p65表達情況。(2)動物實驗:將雄性昆明小鼠隨機分為9組:Sham+Air組、CLP+Air組、CLP+0.5MAC ISO+60%Oxy組、CLP+LV-NC+0.5MAC ISO+60%Oxy組、CLP+LV-mi R-133a-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy組、CLP+LV-mi R-141-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy組、CLP+LV-mi R-3074-2-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy組、CLP+LV-mi R-542-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy組和CLP+LV-mi R-mix+0.5MAC ISO+60%Oxy組。給小鼠尾靜脈注射攜帶LV3-mmu-mi R-133a-3p、LV3-mmumi R-141-3p、LV3-mmu-mi R-3074-2-3p和LV3-mmu-mi R-542-3p質粒的慢病毒,48 h后建立CLP膿毒癥模型。氧醚治療:造模后1、6小時分別吸入1小時的氧醚復合氣體,對照組在相同時間內(nèi)吸入空氣。記錄動物7天存活率。2.抑制miRNA表達對膿毒癥的保護效應研究(1)動物實驗:將雄性昆明小鼠隨機分為8組:Sham組、CLP組、CLP+LV-NC inhibitor/antigomo-NC組、CLP+LV-mi R-133a-3p inhibitor/antigomo-mi R-133a-3p組、CLP+LV-mi R-141-3p inhibitor/antigomo-mi R-141-3p組、CLP+LV-mi R-3074-2-3p inhibitor/antigomo-mi R-3074-2-3p組、CLP+LV-mi R-542-3p inhibitor/antigomomi R-542-3p組和CLP+LV-mi R-mix inhibitor/antigomo-mi R-mix組。給小鼠尾靜脈注射LV3-mmu-mi R-133a-3p-inhibitor、LV3-mmu-mi R-141-3p-inhibitor、LV3-mmu-mi R-3074-2-3p-inhibitor或LV3-mmu-mi R-542-3p-inhibitor質粒的慢病毒,48 h后建立CLP膿毒癥模型。尾靜脈注射miRNA antigomo時間:CLP前48 h或CLP后24 h。記錄動物7天存活率。(2)細胞實驗:將RAW264.7巨噬細胞,隨機分為8組:Vehicle組、LPS組、LPS+LV-NC inhibitor/antigomo-NC組、LPS+LV-mi R-133a-3p inhibitor/antigomomi R-133a-3p組、LPS+LV-mi R-141-3p inhibitor/antigomo-mi R-141-3p組、LPS+LVmi R-3074-2-3p inhibitor/antigomo-mi R-3074-2-3p組、LPS+LV-mi R-542-3p inhibitor/antigomo-mi R-542-3p組和LPS+LV-mi R-mix inhibitor/antigomo-mi R-mix組。用攜帶LV3-mmu-mi R-133a-3p-inhibitor、LV3-mmu-mi R-141-3p-inhibitor、LV3-mmumi R-3074-2-3p-inhibitor或LV3-mmu-mi R-542-3p-inhibitor質粒的慢病毒感染RAW264.7細胞72 h,或者轉染mi R-133a-3p antigomo、mi R-141-3p antigomo、mi R-3074-2-3p antigomo和mi R-542-3p antigomo于RAW264.7細胞12 h后,給予細胞100 ng/ml LPS刺激2小時建立細胞膿毒癥模型。收集細胞培養(yǎng)上清液檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β水平。結果1.本研究中,我們觀察到,LPS刺激后,RAW264.7細胞釋放TNF-α和IL-1β顯著增多(P0.05);給予氧醚復合干預可顯著抑制LPS刺激所致細胞炎癥因子釋放的增加(P0.05)。高表達mi R-133a-3p及mi R-3074-2-3p可顯著逆轉氧醚復合對LPS刺激所致細胞釋放TNF-α增加的抑制效應(P0.05);高表達mi R-542-3p可顯著逆轉氧醚復合對LPS刺激所致細胞釋放IL-1β增加的抑制效應(P0.05)。給予mi R-133a-3p mimic、mi R-3074-2-3p mimic及同時給予上述4個miRNA mimic可顯著逆轉氧醚復合對LPS刺激所致細胞釋放TNF-α增加的抑制效應(P0.05);給予mi R-542-3p mimic及同時給予上述4個miRNA mimic可顯著逆轉氧醚復合對LPS刺激所致細胞釋放IL-1β增加的抑制效應(P0.05)。給予mi R-133a-3p antigomo、mi R-3074-2-3p antigomo及同時給予上述4個miRNA antigomo可顯著增強氧醚復合對LPS刺激所致細胞釋放TNF-α增加的抑制效應(P0.05);給予mi R-542-3p antigomo及同時給予上述4個miRNA antigomo均可顯著增強氧醚復合對LPS刺激所致細胞釋放IL-1β增加的抑制效應(P0.05)。LPS刺激可上調(diào)RAW264.7細胞p-p65表達增加,細胞核p65表達增加,細胞漿p65表達減少,提示:LPS刺激后細胞內(nèi)NF-κB信號通路被激活。給予氧醚復合干預可抑制LPS誘導的NF-κB信號通路激活;預先高表達上述4個miRNA可部分逆轉氧醚復合干預對LPS刺激后NF-κB信號通路激活的抑制效應。動物實驗:與假手術組相比,CLP組小鼠存活率顯著下降(P0.05),給予氧醚復合可顯著提高CLP動物的存活率(P0.05);高表達mi R-141-3p及同時高表達上述4個miRNA可顯著減弱氧醚復合提高CLP小鼠存活率的效應(P0.05)。2.我們觀察到,分別給予mi R-133a-3p、mi R-141-3p、mi R-3074-2-3p和mi R-542-3p inhibitor可提高CLP小鼠的存活率,但沒有統(tǒng)計學差異;而同時給予上述4個miRNA inhibitor可顯著提高CLP小鼠的存活率(P0.05)。此外,造模前同時給予上述4個miRNA antigomo可顯著提高CLP小鼠的存活率(P0.05);造模后分別或同時給予上述4個miRNA antigomo也可提高CLP小鼠的存活率,但沒有統(tǒng)計學差異。給予mi R-133a-3p inhibitor、mi R-3074-2-3p inhibitor及同時給予上述4個miRNA inhibitor可顯著抑制LPS刺激后細胞培養(yǎng)上清液TNF-α水平的增高(P0.05);給予mi R-133a-3p inhibitor、mi R-141-3p inhibitor、mi R-542-3p inhibitor和同時給予上述4個miRNA inhibitor可顯著抑制LPS刺激后細胞培養(yǎng)上清液IL-1β水平的增高(P0.05)。給予mi R-133a-3p antigomo、mi R-3074-2-3p antigomo、mi R-542-3p antigomo及同時給予上述4個miRNA antigomo可顯著抑制LPS刺激后細胞培養(yǎng)上清液TNF-α水平的增高(P0.05);給予mi R-3074-2-3p antigomo及同時給予上述4個miRNA antigomo可顯著抑制LPS刺激后細胞培養(yǎng)上清液IL-1β水平的增高(P0.05)。結論由以上結果可知,(1)miRNA介導的NF-κB炎性通路參與了0.5MAC異氟醚復合60%氧對膿毒癥的保護效應;(2)抑制mi R-133a-3p、mi R-141-3p、mi R-3074-2-3p或mi R-542-3p具有抗炎效應,并對CLP所致膿毒癥有保護效應,提示這4個miRNA有可能成為治療膿毒癥的新靶點。
【關鍵詞】：膿毒癥 異氟醚 氧氣 炎癥 microRNA
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R459.7
【目錄】：

• 縮略語表4-7
• 中文摘要7-11
• Abstract11-17
• 前言17-19
• 文獻回顧19-29
• 第一部分 miRNA通過介導NF-ΚB信號通路參與氧醚復合保護效應29-51
• 1 材料29-33
• 2 方法33-39
• 3 結果39-48
• 4 討論48-51
• 第二部分 抑制miRNA表達對膿毒癥的保護效應研究51-64
• 1 材料51-54
• 2 方法54-56
• 3 結果56-62
• 4 討論62-64
• 小結64-65
• 參考文獻65-75
• 個人簡歷和研究成果75-76
• 致謝76

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本文編號：760535