本文關(guān)鍵詞：溶血磷脂酸抑制辣椒素受體介導(dǎo)膽汁淤積性瘙癢的研究

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【摘要】：瘙癢是一種能引起立即進行搔抓欲望的主觀感覺。臨床上,能夠引起瘙癢的疾病有很多,包括皮膚病、癌癥和系統(tǒng)性疾病等,心理因素也可導(dǎo)致瘙癢的產(chǎn)生。瘙癢可引起失眠、抑郁,甚至自殺傾向,這種癥狀不可忽視。在國外,難以治愈的頑固性瘙癢甚至可以成為肝移植手術(shù)的重要指征。在我國,瘙癢是肝膽系統(tǒng)疾病的常見和多發(fā)癥狀,但是膽汁淤積性肝病導(dǎo)致瘙癢的機制仍不清楚,如何治療膽汁淤積性疾病伴發(fā)的瘙癢也是臨床醫(yī)生的難題。因此,探明膽汁淤積性瘙癢的細胞和分子機制將為探索有效的臨床治療方法提供科學(xué)依據(jù)。近年來的研究發(fā)現(xiàn),膽汁淤積癥患者除了出現(xiàn)瘙癢外,還有一個特征即痛閾明顯升高,手術(shù)中嗎啡消耗量明顯減少。另外,研究者對膽汁淤積動物模型和膽汁淤積性瘙癢患者的研究發(fā)現(xiàn),許多介質(zhì)和受體參與并導(dǎo)致了瘙癢行為的發(fā)生。最近的研究發(fā)現(xiàn),膽汁淤積癥患者血清中溶血磷脂酸(lysophosphatidic,LPA)和自分泌運動因子(autotaxin,ATX)的升高可能是引起瘙癢的的一個關(guān)鍵因素。目前發(fā)現(xiàn)血清ATX與瘙癢程度相關(guān),阻斷ATX的產(chǎn)生對減輕瘙癢程度有效應(yīng)。ATX將血清中的磷脂酰膽堿水解成膽堿基團和LPA。LPA通過LPA受體發(fā)揮作用,研究表明,到目前為止,LPA受體至少有6個亞型。根據(jù)我們以前的工作發(fā)現(xiàn),LPA1受體亞型在正常小鼠和膽汁淤積小鼠的表達量都是最豐富的;另外,與正常小鼠相比,膽汁淤積小鼠的LPA4受體表達增加最為顯著。根據(jù)現(xiàn)有文獻,LPA1受體亞型在痛信號通路中起到重要作用。LPA4受體在膽汁淤積的情況下表達明顯增高,提示LPA4受體可能在癢信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程中發(fā)揮重要功能。因此,我們這個課題著重研究這兩種受體亞型在膽汁淤積性瘙癢中的作用。研究表明,癢神經(jīng)元是脊髓的背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)能表達胃泌素釋放肽(gastrin-releasing peptide,GRP)的中、小神經(jīng)元,其中樞突起投射到脊髓的后角中的I層,與后角I層中能特異性的表達胃泌素釋放肽受體的神經(jīng)元形成突觸聯(lián)系,從而能將來自外周的癢信號向中樞傳遞,因此可以將脊髓的背根神經(jīng)節(jié)(dosal root ganglia,DRG)中GRP表達陽性的神經(jīng)元視作癢神經(jīng)元。TRPV1是重要的介導(dǎo)疼痛產(chǎn)生的離子通道之一,外周的痛信號通過痛信號通路向中樞傳遞。正常情況下,痛信號通路占優(yōu)勢,痛信號通路發(fā)出側(cè)支,通過中間抑制性神經(jīng)元抑制癢信號的傳遞;但在膽汁淤積情況下出現(xiàn)痛行為下降而癢行為增多的現(xiàn)象。那么,膽汁淤積癥患者痛閾的升高是否與TRPV1表達和功能的降低有關(guān),從而成為瘙癢產(chǎn)生的機制之一是我們接下來要做的工作。因此,本課題通過膽總管結(jié)扎的方法建立小鼠膽汁淤積模型,利用“面頰模型”觀察小鼠的擦拭行為和搔抓行為,通過行為學(xué)實驗方法觀察小鼠LPA1受體在膽汁淤積情況下的功能,以及l(fā)pa4受體在膽汁淤積病理情況下的功能。另外,我們應(yīng)用westernblot技術(shù)、免疫熒光染色技術(shù)及單細胞膜片鉗技術(shù)觀察trpv1在膽汁淤積情況下的功能的變化及l(fā)pa對trpv1的作用。通過trpv1通道在膽汁淤積情況下的功能和表達的變化,lpa1受體在膽汁淤積情況下的功能改變,以及l(fā)pa4受體在膽汁淤積病理情況下的功能的研究,明確膽汁淤積時,lpa在瘙癢中發(fā)揮的作用及其發(fā)病機制。我們的研究不僅為探究lpa在慢性膽汁淤積性瘙癢的作用和機制提供新的科學(xué)依據(jù),也為尋找治療慢性頑固性膽汁淤積性瘙癢提供新的方法奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:一、膽汁淤積后lpa抑制了trpv1的功能。1、westernblot技術(shù)研究結(jié)果表明,膽汁淤積(bdl)小鼠trpv1的表達顯著降低。2、單細胞全細胞膜片鉗記錄結(jié)果表明,膽汁淤積后背根節(jié)癢神經(jīng)元trpv1激活誘發(fā)的內(nèi)向電流顯著降低。行為學(xué)實驗研究結(jié)果表明,膽汁淤積后小鼠對trpv1激動劑辣椒素(capsaicin)誘發(fā)的痛樣行為顯著減少,搔抓行為沒有明顯的變化,提示膽汁淤積后trpv1的功能降低。3、單細胞全細胞膜片鉗記錄結(jié)果表明,在膽汁淤積小鼠,lpa顯著抑制trpv1激動劑辣椒素(capsaicin)誘發(fā)的內(nèi)向電流。行為學(xué)實驗結(jié)果表明,小鼠尾靜脈注射lpa后,trpv1激動劑辣椒素(capsaicin)引起的膽汁淤積小鼠痛樣反應(yīng)顯著降低,表明膽汁淤積情況下,lpa抑制了trpv1的功能。二、抑制lpa1受體功能,增強瘙癢反應(yīng)。1、免疫熒光染色技術(shù)研究結(jié)果表明,lpa1受體在癢神經(jīng)元上表達,提示lpa1受體可能與瘙癢的發(fā)生有關(guān)。2、行為學(xué)實驗結(jié)果表明,對sham小鼠應(yīng)用lpa1受體特異性阻斷劑ki16425抑制lpa1受體,可減輕lpa誘發(fā)的疼痛反應(yīng),并增加搔抓反應(yīng),提示抑制lpa1受體的功能可增強瘙癢反應(yīng)。3、行為學(xué)實驗結(jié)果表明,對sham和bdl小鼠應(yīng)用lpa1受體相對選擇性激動劑vpc31143(r)后,發(fā)現(xiàn)與sham組小鼠相比,膽汁淤積小鼠的痛樣行為顯著降低,提示膽汁淤積情況下,lpa1受體功能降低。三、激活lpa4受體功能,增強瘙癢反應(yīng)。1、行為學(xué)實驗結(jié)果表明,在sham小鼠,lpa主要誘發(fā)疼痛反應(yīng);而lpa4受體選擇性激動劑vpc31144(s)誘發(fā)搔抓反應(yīng)。2、行為學(xué)實驗結(jié)果表明,在膽汁淤積小鼠,選擇性激活lpa4受體引起顯著的搔抓反應(yīng),提示LPA4受體可能介導(dǎo)瘙癢反應(yīng)。3、行為學(xué)實驗結(jié)果表明,LPA4受體選擇性激動劑VPC31144(S)呈劑量依賴性誘發(fā)SHAM小鼠和BDL小鼠的搔抓反應(yīng)。綜上所述,我們的研究結(jié)果表明,在膽汁淤積的病理情況下,TRPV1的表達和功能下降,LPA抑制了TRPV1的功能;膽汁淤積后LPA1受體功能受到抑制;選擇性激活LPA4受體誘發(fā)搔抓反應(yīng)而不產(chǎn)生疼痛反應(yīng)。這些結(jié)果提示,在膽汁淤積的情況下,LPA可能通過抑制TRPV1的功能以及LPA1受體功能的降低從而導(dǎo)致痛閾升高成為瘙癢的機制之一;此外,LPA4受體功能的增強可能是LPA直接誘發(fā)瘙癢的機制。
【關(guān)鍵詞】：瘙癢 溶血磷脂酸 痛 膽汁淤積 溶血磷脂酸受體
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R441
【目錄】：

• 摘要7-10
• Abstract10-13
• 縮略詞表13-14
• 一、前言14-16
• 二、材料與方法16-27
• （一）實驗材料16-21
• 1、主要試劑16-17
• 2、實驗儀器設(shè)備17-19
• 3、試劑配制19-21
• 4、實驗動物21
• （二）實驗方法21-27
• 1、通過膽總管結(jié)扎(Bile duct ligation，BDL)建立膽汁淤積小鼠模型?21
• 2、區(qū)分痛和癢的"面頰模型"21-22
• 3、癢行為觀察22
• 4、蛋白質(zhì)的提取和Western blot技術(shù)22-23
• 5、小鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞分離及培養(yǎng)23-24
• 6、電生理實驗技術(shù)24-25
• 7. 免疫熒光染色技術(shù)25-26
• 8、統(tǒng)計學(xué)處理26-27
• 三、實驗結(jié)果27-38
• （一） 膽汁淤積后LPA抑制TRPV1功能27-31
• 1、膽汁淤積后TRPV1的表達降低27-28
• 2、膽汁淤積后TRPV1的功能降低28-30
• 3、LPA抑制TRPV1的功能30-31
• （二） 抑制LPA_1受體功能，增強瘙癢反應(yīng)31-34
• 1、LPA_1在癢神經(jīng)元的表達31-32
• 2、抑制LPA_1減輕疼痛反應(yīng)，增加搔抓行為32-34
• 3、膽汁淤積后LPA_1受體功能降低34
• （三） 激活LPA_4受體功能，增強瘙癢反應(yīng)34-38
• 1、在正常小鼠，LPA誘發(fā)小鼠疼痛反應(yīng)，，LPA_4受體選擇性激動劑誘發(fā)搔抓反應(yīng)34-35
• 2、在膽汁淤積小鼠，選擇性激活LPA_4受體引起搔抓反應(yīng)35-36
• 3、LPA_4選擇性激動劑VPC31144(S) 呈劑量依賴性誘發(fā)搔抓反應(yīng)36-38
• 四、討論38-43
• （一） 膽汁淤積后LPA抑制TRPV1功能38-40
• 1、膽汁淤積抑制TRPV1表達和功能38-39
• 2、LPA對TRPV1的抑制作用39-40
• （二） 膽汁淤積抑制LPA_1受體功能，增強瘙癢反應(yīng)40-41
• （三） 激活LPA_4受體功能，增強瘙癢反應(yīng)41-43
• 五、結(jié)論43-44
• 參考文獻44-47
• 綜述 感覺神經(jīng)元中的溶血磷脂酸及其信號通路47-63
• 參考文獻56-63
• 發(fā)表論文情況63-64
• 致謝64

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本文編號：719314