本文關鍵詞：維生素E對鐵過負荷肝臟組織細胞氧化應激和炎癥反應的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景鐵是人體必需的微量元素之一,參與機體多種生理生化過程,包括氧氣運輸、DNA合成、電子傳遞等。以往的研究主要集中在缺鐵性貧血,近年來,研究者發(fā)現鐵過負荷同樣對機體具有嚴重危害。肝臟是調控機體鐵穩(wěn)態(tài)的主要器官,許多疾病伴有不同程度的肝鐵沉積,例如β-地中海性貧血(β-Thalassemia),該病患者由于反復輸血導致肝臟鐵沉積(又稱輸入性鐵過負荷),同時可見血清丙二醛(malonyldialdehyde, MDA)含量、炎性因子和轉氨酶升高。大量研究證實,鐵通過催化Fenton反應產生活性氧(Reactive oxidative species, ROS),損害脂質、蛋白、核酸,造成氧化應激損傷,進而激活巨噬細胞導致炎癥反應。近年來有研究報道,miR-122和miR-146a的表達變化在炎癥反應中具有重要作用。有意義的是,本課題組前期研究發(fā)現,肝臟鐵過負荷除了可以引起肝臟組織細胞氧化應激損傷之外,還可以抑制肝細胞核轉錄因子4a (Hepatocyte nuclear factor 4a, HNF4a)和miR-122和miR-146a表達,進而激活NF-κB信號通路,引起炎癥反應。Vit.E (Vitamin E, Vit.E)作為一種廣泛應用的抗氧化維生素,可清除體內多余的ROS,維持機體氧化與抗氧化系統(tǒng)的平衡。有研究報道,Vit.E補充可降低鐵過負荷導致的氧化應激。但是,另有研究報道,過量的Vit.E補充可加重鐵過負荷氧化應激狀態(tài)。Vit.E對鐵過負荷氧化應激的影響存在爭議。已知,臨床采用Vit.E防治地中海貧血患者紅細胞氧化損傷,其是否可以防治鐵過負荷引起的肝臟組織細胞氧化應激損傷以及炎癥反應未見報道。研究目的本課題通過動物和細胞實驗,觀察Vit.E補充對鐵過負荷肝臟組織細胞氧化應激和炎癥反應的影響,為今后臨床上是否采用Vit.E補充這一方法防治鐵過負荷肝臟損傷相關疾病提供實驗依據。研究方法一、動物分組與處理24只雄性4周齡C57BL/6小鼠,按體重隨機分組：對照組(Ctrl)、鐵過負荷(IO)組、鐵過負荷+玉米油(IO+corn oil)組、鐵過負荷+Vit.E (IO+Vit.E)組,每組6只。對照組腹腔注射0.9%生理鹽水,其余三組腹腔注射右旋糖酐鐵(20 mg/ml),每次0.15ml,每周2次,共2周,總鐵量12 mg。IO+Vit.E組小鼠每天灌胃溶于玉米油的Vit.E(100 mg/kg·bw), IO+corn oil組小鼠每天灌胃與Vit.E等體積的玉米油,共2周,IO+corn oil作為溶劑對照組。二、部分血清生化參數和肝鐵含量的檢測采用全自動血生化儀檢測各組小鼠血清中血清鐵(SI)、轉鐵蛋白飽和度(TS)、總鐵結合力(TIBC)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)等參數。硝化法測肝鐵含量。肝臟普魯士藍染色觀察肝鐵沉積情況。三、肝臟氧化應激指標的檢測ROS含量測定：制備小鼠肝臟組織勻漿液,離心吸取上清液,用ROS檢測探針DCF 37℃避光孵育1 h (DCF終濃度為5μM),酶標儀檢測熒光強度。丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽(GSH)含量檢測：肝臟組織勻漿處理,然后按說明書操作進行。8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG):采用免疫熒光方法,操作按照說明書進行。四、肝臟HE染色及炎癥病理評分肝臟組織用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋。攤片,厚度為4μm,然后用蘇木精和伊紅染色。顯微鏡下觀察并拍照,按照1985年lok.Schener評價慢性肝炎合并HDV感染方法進行炎癥病理評分。五、細胞培養(yǎng)與處理人肝癌細胞株Huh7細胞分為對照組、Holo-Tf組(Holo-transferrin)和Holo-Tf+Vit.E組。Holo-Tf組加入Holo-Tf(終濃度為30 μM),Holo-Tf+Vit.E組同時加入Holo-Tf(終濃度為30μM)和Vit.E(終濃度為50 μM),對照組加入無菌RNase Free ddH2O,干預時間為24h。細胞羥自由基(·OH)含量、SOD活性、MDA含量、GSH含量的檢測：細胞用添加Holo-Tf和Vit.E的培養(yǎng)液培養(yǎng)后,制備肝細胞懸液,然后按說明書操作進行。六、實時定量熒光PCR用Trizol裂解組織或者細胞,按比例加入氯仿進行萃取。離心取上層水相,用異丙醇沉淀RNA。75%乙醇將沉淀洗2遍,得到的白色絮狀沉淀即為RNA。加入20μl左右RNase Free ddH2O溶解。測RNA濃度,再將RNA反轉錄成cDNA。按照目的基因的正反引物及內參基因正反引物,SYBR Green, cDNA, DEPC水進行實時定量熒光聚合酶鏈式反應。動物內參為18S,細胞內參為β-actin。根據擴增得到的Ct值計算RQ值,并進行統(tǒng)計分析。七、Western blot肝臟組織或細胞加入蛋白裂解液(lysis buffer:蛋白酶抑制劑：磷酸酶抑制劑：PMSF體積比為1 ml:1 μl:10 μl:5 μl)。經勻漿、裂解、離心后,吸取蛋白上清液,然后上清液和loading buffer按4：1比例進行蛋白變性。用BCA試劑盒定量。蛋白經電泳、轉膜,封閉,一抗孵育,洗膜,二抗孵育,洗膜,加顯影液顯蛋白條帶,條帶進行灰度分析,最終統(tǒng)計分析不同蛋白的表達情況。八、統(tǒng)計和分析數據用x±s表示,用SPSS 21.0軟件分析。多組間比較采用方差分析。以P0.05,P0.01,P0.001表示差異有統(tǒng)計學意義。結果一、Vit.E對鐵過負荷小鼠和Huh7細胞鐵狀態(tài)的影響1.小鼠的一般情況IO組與對照組比較,小鼠體重和進食量無差異。IO+Vit.E與IO+corn oil組比較,小鼠體重和進食量無差異。IO+Vit.E與IO+corn oil組小鼠的體重和進食量低于對照組。2.小鼠的鐵負荷狀態(tài)(1)小鼠血清鐵相關參數和肝鐵含量與對照組比較,IO、IO+corn oil、IO+Vit.E組小鼠SI、TS、肝鐵含量均顯著升高。給鐵的同時給予Vit.E補充后,IO、IO+corn oil、IO+Vit.E組小鼠之間SI、TS、肝鐵含量無顯著性差異。與對照組比較,IO、IO+corn oil、IO+Vit.E組小鼠肝臟普魯士藍染色均可見明顯鐵沉積。(2)小鼠肝臟鐵代謝調節(jié)分子的表達變化與對照組比較,IO、IO+corn oil、IO+Vit.E組小鼠肝臟FTL1, HAMP mRNA和蛋白表達顯著升高,TFRC mRNA和蛋白表達顯著降低。而給鐵的同時給予Vit.E補充后,IO、IO+corn oil和IO+Vit.E組小鼠之間肝臟FTL1, TFRC, HAMP mRNA和蛋白表達無顯著性差異。3.鐵過負荷Huh7細胞鐵代謝調節(jié)分子表達變化與對照組比較,在添加30 μM Holo-Tf的細胞培養(yǎng)液中暴露24h, Huh7田胞鐵代謝調節(jié)分子FTL1, HAMP mRNA和蛋白表達升高,TFRC mRNA和蛋白表達降低。與單純Holo-Tf組相比,在添加30 μM Holo-Tf同時添加50 μM Vit.E的細胞培養(yǎng)液中暴露24h, Huh7細胞鐵代謝調節(jié)分子FTL1, HAMP, TFRC mRNA和蛋白表達無顯著性差異。二、Vit.E對鐵過負荷肝臟組織細胞氧化應激的影響(一)Vit.E對鐵過負荷小鼠肝臟組織氧化應激的影響1. Vit.E對鐵過負荷小鼠肝臟ROS、MDA、GSH含量和SOD活性的影響與對照組比較,IO、IO+corn oil組肝臟ROS和MDA含量升高,而SOD活性和GSH含量降低。與IO組比較,I0+Vit.E組肝臟ROS和MDA含量降低,而SOD活性和GSH含量升高。2. Vit.E對鐵過負荷小鼠肝臟8-OHdG含量的影響與對照組比較,IO、IO+corn oil組肝臟8-OHdG熒光強度增強。與IO組比較,IO+Vit.E組肝臟8-OHdG熒光強度減弱。(二)Vit.E對鐵過負荷Huh7細胞氧化應激的影響1. Vit.E對鐵過負荷Huh7細胞·OH含量的影響與對照組相比,在添加30 μM Holo-Tf的細胞培養(yǎng)液中暴露24h, Huh7細胞內·OH顯著升高；與單純Holo-Tf組相比,在添加30 μM Holo-Tf同時分別添加0,25,50,100 μM Vit.E的細胞培養(yǎng)液中暴露24h, Huh7細胞內·OH含量呈現不同程度的降低,有一定的量效關系,但50μM組與100μM的·OH含量沒有明顯差異。2. Vit.E對鐵過負荷Huh7細胞MDA、GSH含量和SOD活性的影響與對照組相比,在添加30 μM Holo-Tf的細胞培養(yǎng)液中暴露24h,Huh7細胞MDA含量升高,SOD活性和GSH含量降低。與單純Holo-Tf組相比,在添加30 μM Holo-Tf同時添加50 μM Vit.E的細胞培養(yǎng)液中暴露24h, Huh7細胞MDA含量有所降低,SOD活性和GSH含量有所升高。三、Vit.E對鐵過負荷肝臟組織細胞炎癥反應的影響(一)Vit.E對鐵過負荷小鼠肝臟組織炎癥反應的影響1. Vit.E對鐵過負荷小鼠肝臟炎性因子表達的影響與對照組比較,IO、IO+corn oil、IO+Vit.E組小鼠肝臟p65, TNFα, IL-6 mRNA和蛋白表達均升高。與IO組比較,IO+corn oil、IO+Vit.E組之間小鼠肝臟p65, TNFα, IL-6 mRNA和蛋白表達無顯著性差異。2. Vit.E對鐵過負荷小鼠肝臟炎癥評分的影響與對照組比較,IO、IO+corn oil、IO+Vit.E組小鼠肝臟HE染色病理切片的炎癥評分均顯著升高。而IO、IO+corn oil、IO+Vit.E組小鼠之間肝臟炎癥評分無顯著性差異。3. Vit.E對鐵過負荷小鼠血清AST、ALT水平的影響與對照組比較,IO、IO+corn oil、IO+Vit.E組小鼠血清AST、ALT水平均顯著升高。而IO、IO+corn oil、IO+Vit.E組小鼠之間血清AST、ALT水平無顯著性差異。(二)Vit.E對鐵過負荷Huh7細胞炎性因子表達的影響與對照組相比,在添加30 μM Holo-Tf的細胞培養(yǎng)液中暴露24h, Huh7細胞炎性因子p65, TNFα, IL-6 mRNA和蛋白表達均顯著升高。與單純Holo-Tf組相比,在添加30 μM Holo-Tf同時添加50 μM Vit.E的細胞培養(yǎng)液中暴露24h,Huh7細胞p65,TNFα,IL-6 mRNA和蛋白的表達無顯著性差異。(三)Vit.E對鐵過負荷Huh7細胞HNF4α, miR-122, miR-146a, CCL2, TRAF6表達的影響在添加30 μM Holo-Tf的細胞培養(yǎng)液中暴露24h,Huh7細胞HNF4α, miR-122, miR-146a表達顯著下調,miR-122和niR-146a的靶基因CCL2,TRAF6表達顯著升高。與單純Holo-Tf組相比,在添加30 μM Holo-Tf同時添加50 μM Vit.E的細胞培養(yǎng)液中暴露24h, Huh7細胞HNF4α, miR-122, miR-146a, CCL2, TRAF6表達無顯著性差異。結論綜合本課題的研究結果,表明,鐵過負荷可引起肝臟組織細胞氧化應激損傷和炎癥反應；Vit.E補充可以緩解鐵過負荷引起的肝臟組織細胞氧化應激,但不能緩解鐵過負荷引起的肝臟組織細胞炎癥反應。Vit.E補充對鐵過負荷肝細胞HNF4α及miR-122,miR-146a表達下降,NF-κB信號通路活性增強沒有明顯影響。因此,采用Vit.E補充防治鐵過負荷肝臟損傷相關疾病還需要進一步深入研究。
【關鍵詞】：維生素E 鐵過負荷 氧化應激 炎癥反應
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R459.3
【目錄】：

• 摘要5-11
• Abstract11-18
• 中英文縮略詞表18-19
• 前言19-20
• 一、材料與方法20-35
• 二、結果35-44
• 三、討論44-47
• 參考文獻47-50
• 全文總結50-51
• 綜述 鐵過負荷危害研究進展51-55
• 參考文獻55-58
• 攻讀學位期間發(fā)表論文和參加科研工作情況58-59
• 致謝59-60

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