本文關(guān)鍵詞： 單細(xì)胞 造血干細(xì)胞 小分子 化合物篩選 抗氧化 小分子化合物 造血干細(xì)胞　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：實(shí)驗(yàn)背景：造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells, HSCs)是目前研究最為深入的一類干細(xì)胞,它具有自我更新及多向分化兩大重要特點(diǎn),能夠在保持干細(xì)胞池相對穩(wěn)定的同時(shí)增殖分化為復(fù)雜造血系統(tǒng)中的各系血細(xì)胞。然而,HSCs在骨髓及臍帶血中比例極低,基礎(chǔ)研究及臨床移植中用到的HSCs又多為異質(zhì)性的細(xì)胞群體,即HSCs及定向分化的造血祖細(xì)胞混合體,雖然臍帶血的應(yīng)用大大降低了臨床用造血干細(xì)胞對組織相容性抗原(HLA)的要求,但臍帶血仍無法滿足成人移植所需的造血干細(xì)胞量�；诖�,臨床移植面臨HSCs數(shù)目不足及移植用HSCs無統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等問題亟待解決。小分子化合物在HSCs調(diào)控領(lǐng)域以其濃度可精確調(diào)控、結(jié)構(gòu)多樣方便優(yōu)化、易于處理等特點(diǎn)顯示出極大優(yōu)勢,已有研究證實(shí),SR1及UM71兩種小分子化合物單獨(dú)使用及組合使用均可顯著擴(kuò)增HSPCs(hematopoietic stem/progenitor cells),其擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)到100倍以上。近年興起的單細(xì)胞技術(shù),可有效解決細(xì)胞異質(zhì)性問題,細(xì)胞表面標(biāo)記研究結(jié)合先進(jìn)的流式細(xì)胞分選平臺(tái),使得純化獲取單個(gè)hHSC成為可能。已有研究表明,造血干細(xì)胞的表面標(biāo)記除了經(jīng)典的CD34、CD38外,CD90、CD45RA以及HSCs特異性標(biāo)記CD49f,的表面標(biāo)記組合可將HSCs與造血祖細(xì)胞充分區(qū)分開來,從而獲得單純的HSCs。體外造血功能實(shí)驗(yàn)CFC(colony forming cells)及 CAFC(cobblestone area forming cells)可用于體外驗(yàn)證HSCs功能,其中CFC側(cè)重于觀測多能祖細(xì)胞的分化能力,CAFC可反映培養(yǎng)系統(tǒng)中具有長期造血重建能力的HSCs。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模罕狙芯恐饕ㄟ^利用對HSCs有明顯擴(kuò)增作用的小分子化合物SR1及UM171,構(gòu)建多參數(shù)單細(xì)胞的流式分選及培養(yǎng)體系,通過對分選得到的單個(gè)hHSC體外培養(yǎng)后流式檢測及形態(tài)分析,以及體外造血功能實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證本單個(gè)hHSC體外培養(yǎng)體系的穩(wěn)定性和可靠性,以便用于后續(xù)調(diào)控HSCs功能的小分子化合物篩選。實(shí)驗(yàn)方法：首先,我們通過CD34+細(xì)胞體外培養(yǎng)確定SR1及UM171的使用濃度,再通過實(shí)驗(yàn)摸索得到單細(xì)胞培養(yǎng)最適宜的培養(yǎng)基體系,利用BD INFLUX流式分選儀將單個(gè)DAPI-CD34+CD38+CD90+CD45RA-CD49f+細(xì)胞分選到96孔板中進(jìn)行14d體外培養(yǎng),并完成培養(yǎng)后流式分析及細(xì)胞形態(tài)檢測,分析單個(gè)hHSC培養(yǎng)體系中小分子化合物的作用。利用經(jīng)典的體外造血功能實(shí)驗(yàn)作一對比,以此驗(yàn)證體系的穩(wěn)定性。結(jié)果：CD34+細(xì)胞體外培養(yǎng)確定了化合物使用濃度為SR1(1μmol/L), UM171 (35nmol/L),SR1+UM171(750nmol/L+35nmol/L)。單個(gè)hHSC體外培養(yǎng)14天流式結(jié)果顯示,化合物處理組較對照組相比,有效孔數(shù)明顯增加,在各孔細(xì)胞總數(shù)無明顯差異的情況下,化合物處理組CD34+細(xì)胞及CD34+CD49f細(xì)胞絕對數(shù)及比例顯著增高(P0.05),幾乎所有有效孔細(xì)胞均向髓系、淋系兩大方向分化,未出現(xiàn)偏系分化,細(xì)胞染色結(jié)果與流式檢測結(jié)果一致。CFC結(jié)果顯示,處理組克隆總數(shù)及各種克隆數(shù)目較對照組顯著增加,且克隆形態(tài)及各種克隆比例無差異。CAFC泊松分布結(jié)果表明,處理組HSCs頻率較對照組明顯上升(P0.05)。結(jié)論：此構(gòu)建的單個(gè)hHSC體外培養(yǎng)體系可保證SR1及UM171處理?xiàng)l件下,HSC保持自我更新同時(shí)仍具有多向分化潛能,縮短了體外擴(kuò)增及驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)周期,初步解決了HSCs研究面臨的異質(zhì)性問題,為之后篩選靶向HSC的小分子化合物奠定了基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)背景：HSCs在早期發(fā)育及生命過程中,發(fā)揮著維持組織穩(wěn)態(tài)等生理學(xué)功能。其自我更新及多向分化兩大特性之間的平衡,對于HSCs的功能起著至關(guān)重要的作用。近年來對于胚胎干細(xì)胞及成體干細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn),這一平衡可以由活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)來調(diào)節(jié),ROS可以改變細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài),實(shí)現(xiàn)代謝的同步性。但是,研究證實(shí),HSCs在低氧環(huán)境生存,較低的ROS水平可以幫助維持長期HSCs的生物學(xué)功能,提高移植成功率。HSCT不僅需要保證細(xì)胞的功能,還需要有用于移植的足夠數(shù)量的細(xì)胞,這也是急需解決的一個(gè)問題。人體的抗氧化防御系統(tǒng)是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng),它能夠維持較低的ROS水平,同時(shí)確保機(jī)體內(nèi)的ROS作為第二信使行使信號傳導(dǎo)功能,此系統(tǒng)如不能完成恰當(dāng)?shù)难趸�原調(diào)控,可能會(huì)造成ROS水平升高導(dǎo)致氧化應(yīng)激發(fā)生,需要有外界抗氧化物介入調(diào)節(jié)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^對抗氧化小分子化合物庫中的85種小分子化合物進(jìn)行篩選,得到對HSCs有明顯體外擴(kuò)增作用的幾種小分子化合物,并初步驗(yàn)證其對HSCs生物學(xué)功能的影響,進(jìn)而研究其抗氧化作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法：首先由于小分子化合物庫中的抗氧化物在HSCs領(lǐng)域未有報(bào)道,需要利用CD34+細(xì)胞體外擴(kuò)增的方法,確定化合物的使用濃度,經(jīng)過初篩以及設(shè)計(jì)化合物濃度梯度,體外培養(yǎng)后流式分析CD34+細(xì)胞及CD34+CD49f+細(xì)胞絕對數(shù)及比例,得到合適的化合物濃度。通過體外造血功能實(shí)驗(yàn)CFC(細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn),colony forming cell assay)驗(yàn)證其對HSCs自我更新及多向分化兩大方面的影響。結(jié)果：初步篩選85種抗氧化小分子化合物得到對CD34+細(xì)胞以及CD34+CD49+細(xì)胞均有顯著作用(P0.05)的9種化合物,分別為C2968 (5μM)、B1753 (20μM)、 B3358 (10μM)、C0168 (10μM)、D3331 (5μM)、B8071 (20μM)、B8174(10μM)、 C0263 (20μM)、C2943 (10μM) 。綜合化合物濃度及擴(kuò)增效果兩方面因素選取C2968(5μM)、B1753 (20μM)、B3358 (10μM)、C0168 (10μM)、D3331 (5μM)五種小分子化合物進(jìn)行濃度梯度實(shí)驗(yàn),確定使用濃度。細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)CFC結(jié)果顯示化合物C2968 (0.5μM)、B1753 (1.5μM)、B3358 (15μM)、D3331(1.5μM)處理組較對照組而言,細(xì)胞的集落形成能力顯著增強(qiáng)(P0.05),化合物處理可維持各類血細(xì)胞的祖細(xì)胞多向分化潛能,特別是多能祖細(xì)胞的造血能力。結(jié)論：抗氧化小分子化合物C2968 (0.5μM)、B1753 (1.5μM)、B3358(15μM)、 D3331 (1.5μM)具有較好的HSCs體外擴(kuò)增效果,在維持HSCs自我更新的同時(shí)能夠保證其多向分化潛能不受影響。C2968 (0.5μM)、B1753 (1.5μM)、B3358 (15μM)、 D3331 (1.5μM)可以作為HSCs體外擴(kuò)增的新工具,幫助了解HSCs內(nèi)的抗氧化機(jī)制,為基礎(chǔ)研究領(lǐng)域HSCs擴(kuò)增及生理學(xué)功能研究,以及HSCs臨床移植提供新的方向。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R457.7

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本文編號：1526683