本文關鍵詞：基于滾環(huán)擴增和核酸外切酶Ⅲ輔助循環(huán)放大的高靈敏熒光生物傳感器研究

  更多相關文章： 熒光生物傳感器 滾環(huán)擴增 核酸外切酶Ⅲ S1核酸酶 Micro RNA 三磷酸腺苷

【摘要】：滾環(huán)擴增(RCA)作為一種等溫放大過程,有著極強的核酸擴增能力,不僅可直接對特定的DNA分子進行擴增,還能將靶核酸的信號進行放大,得到一條由環(huán)形DNA模板互補序列串聯(lián)組成的長單鏈DNA。通過設計環(huán)形DNA模板的序列,可賦予RCA產物藥物負載、靶標識別、熒光成像等功能。核酸外切酶Ⅲ因其高效的催化水解能力以及對3’端平齊或凹陷的雙鏈DNA特異的識別能力被廣泛應用到信號放大戰(zhàn)略中。本研究論文將滾環(huán)擴增技術和核酸外切酶Ⅲ輔助循環(huán)放大技術與生物傳感方法相結合,構建了一種多重信號放大的熒光生物傳感平臺,實現(xiàn)對核酸酶、micro RNA、小分子物質和離子的檢測。(1)第二章,基于滾環(huán)擴增(RCA)和核酸外切酶Ⅲ (Exo Ⅲ)輔助循環(huán)放大,構建了一個穩(wěn)健的傳感平臺用于S1核酸酶的高靈敏檢測。將S1核酸酶的底物DNA鏈(sDNA)設計成引發(fā)RCA的引物DNA鏈,得到的RCA產物與大量TaqMan探針互補雜交形成TaqMan探針3’端凹陷的雙鏈結構,在Exo Ⅲ的存在下,TaqMan探針從3’端開始被水解,其上的熒光基團被釋放產生熒光信號。與此同時,3’端凸出的RCA產物則免遭酶切繼續(xù)與其它TaqMan探針雜交,循環(huán)往復,產生顯著增強的熒光信號。當體系中存在S1核酸酶時,sDNA被水解成單個或小片段的脫氧核糖核苷酸,此時缺乏引物DNA鏈,致使RCA反應和后續(xù)的Exo Ⅲ輔助循環(huán)放大反應無法進行,從而檢測不到熒光信號,且熒光強度隨S1核酸酶濃度的增加而降低。由于進行了雙重信號放大,該方法展示了極其優(yōu)異的靈敏性,對S1核酸酶的檢測下限達到了5.0×10-7UμL-1。該傳感器用于實際樣品分析中也有令人滿意的結果。(2)第三章,建立了一種利用滾環(huán)擴增(RCA)連接兩次核酸外切酶Ⅲ (Exo Ⅲ)輔助循環(huán)放大(Exo Ⅲ-RCA-Exo Ⅲ)的熒光傳感平臺用于超靈敏地檢測microRNA。設計的3’端凸出的發(fā)夾DNA集識別靶標和信號轉導多種功能于一體,發(fā)夾DNA和目標micro RNA互補雜交后形成雙鏈部分的序列將被Exo Ⅲ水解移除,從而釋放出可繼續(xù)打開其它發(fā)夾DNA的目標micro RNA和引發(fā)RCA反應的引物DNA鏈。該引物鏈可與RCA中的環(huán)形DNA模板雜交并延伸得到RCA產物,RCA產物上包含成千上萬個可與TaqMan探針互補雜交的序列,雜交后形成TaqMan探針的3’端凹陷、RCA產物3’端凸出的單雙鏈串聯(lián)結構,在Exo Ⅲ的存在下,TaqMan探針被水解,熒光基團脫離淬滅基團,產生熒光信號。該方法的動態(tài)響應范圍達到七個數(shù)量級,且檢測限達到了0.32 aM。(3)第四章,基于滾環(huán)擴增(RCA)和核酸外切酶Ⅲ (Exo Ⅲ)輔助循環(huán)的雙重放大熒光傳感平臺,利用一些物質(ATP、鉀離子)對S1核酸酶活性的抑制作用實現(xiàn)了對ATP和K~+的檢測。S1核酸酶是單鏈特異性核酸內切酶,因體系中存在S1核酸酶,單鏈的RCA引物鏈(t-DNA)被水解成單個或小片段的核苷酸,因此無法引發(fā)RCA反應,后續(xù)的Exo Ⅲ酶切反應也無法進行,致使熒光信號難以被檢測。當反應體系中存在ATP或K~+時,t-DNA因S1核酸酶的水解活性被抑制而免遭水解,RCA反應和Exo Ⅲ輔助的熒光信號放大反應順利進行,熒光大大增強。ATP和K~+的線性響應范圍分別為5-200 nM和0.5-5 mM,檢測下限分別為0.5 nM和2 nM。此外,該方法還可用于核酸酶抑制劑的篩選。
【關鍵詞】：熒光生物傳感器 滾環(huán)擴增 核酸外切酶Ⅲ S1核酸酶 Micro RNA 三磷酸腺苷
【學位授予單位】：湖南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：O657.3;TP212.3
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第1章 緒論11-25
• 1.1 熒光生物傳感器11-16
• 1.1.1 熒光產生的原理12
• 1.1.2 熒光生物傳感器的分類12-15
• 1.1.3 熒光生物傳感器的應用15-16
• 1.2 滾環(huán)擴增技術16-20
• 1.2.1 滾環(huán)擴增的原理16-17
• 1.2.2 滾環(huán)擴增的分類17-18
• 1.2.3 滾環(huán)擴增的發(fā)展與應用18-20
• 1.3 基于核酸切割酶的信號放大技術在生物傳感中的應用20-23
• 1.3.1 基于核酸內切酶的信號放大技術20-21
• 1.3.2 基于核酸外切酶的信號放大技術21-23
• 1.4 本論文構思23-25
• 第2章 基于滾環(huán)擴增和核酸外切酶Ⅲ輔助循環(huán)的雙重放大熒光傳感器用于S1核酸酶的高靈敏檢測25-37
• 2.1 前言25-26
• 2.2 實驗部分26-27
• 2.2.1 試劑和儀器26
• 2.2.2 環(huán)形探針的制備26-27
• 2.2.3 S1核酸酶的檢測27
• 2.2.4 滾環(huán)擴增反應27
• 2.2.5 核酸外切酶Ⅲ輔助的循環(huán)放大27
• 2.3 結果與討論27-36
• 2.3.1 實驗原理27-28
• 2.3.2 傳感器的驗證28-29
• 2.3.3 實驗條件優(yōu)化29-33
• 2.3.4 S1核酸酶的檢測分析33-35
• 2.3.5 選擇性考察35
• 2.3.6 實際樣品分析35-36
• 2.4 小結36-37
• 第3章 基于滾環(huán)擴增橋連的兩次核酸外切酶Ⅲ輔助循環(huán)的多重放大熒光傳感器用于micro RNA的超靈敏檢測37-46
• 3.1 前言37-38
• 3.2 實驗部分38-40
• 3.2.1 試劑和儀器38-39
• 3.2.2 環(huán)形探針的制備39
• 3.2.3 核酸外切酶Ⅲ輔助的目標micro RNA循環(huán)放大39
• 3.2.4 滾環(huán)擴增反應39-40
• 3.2.5 核酸外切酶Ⅲ輔助的熒光信號放大40
• 3.3 結果與討論40-45
• 3.3.1 實驗原理40-41
• 3.3.2 傳感器的驗證41-42
• 3.3.3 實驗條件的優(yōu)化42-44
• 3.3.4 micro RNA的檢測分析44
• 3.3.5 選擇性考察44-45
• 3.4 小結45-46
• 第4章 基于滾環(huán)擴增和核酸外切酶Ⅲ輔助循環(huán)的雙重放大熒光傳感器用于ATP和K~+的檢測46-54
• 4.1 前言46-47
• 4.2 實驗部分47-48
• 4.2.1 試劑和儀器47-48
• 4.2.2 環(huán)形探針的制備48
• 4.2.3 ATP和K~+的檢測48
• 4.2.4 滾環(huán)擴增反應48
• 4.2.5 核酸外切酶Ⅲ輔助的循環(huán)放大48
• 4.3 結果與討論48-53
• 4.3.1 檢測原理48-49
• 4.3.2 傳感器的驗證49-50
• 4.3.3 實驗條件的優(yōu)化50-51
• 4.3.4 ATP和K~+的檢測分析51-52
• 4.3.5 選擇性考察52-53
• 4.4 小結53-54
• 結論54-55
• 參考文獻55-69
• 附錄A 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文69-70
• 致謝70

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 牛淑妍;渠麗景;;基于核酸外切酶Ⅲ降解原理熒光檢測乙肝病毒HBV[J];青島科技大學學報(自然科學版);2010年06期

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉陳力為;基于滾環(huán)擴增和核酸外切酶Ⅲ輔助循環(huán)放大的高靈敏熒光生物傳感器研究[D];湖南大學;2016年

，

本文編號：692589