發(fā)布時間：2022-09-21 20:21

　　腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factorα,TNFα）是一種多功能細胞因子,由巨噬細胞、成纖維細胞、T細胞和B細胞等多種細胞類型表達和分泌。它通過與細胞表面的受體TNFR1和TNFR2相互作用,發(fā)揮其正常的生理功能,如促炎癥級聯(lián)、凋亡、細胞增殖和免疫調(diào)節(jié)等。然而,在患有自身免疫性疾病的患者中,高水平的TNFα可導致不必要的炎癥和細胞毒性,從而進一步導致疼痛癥狀。此外,TNFα和肥胖-糖尿病綜合征、重度抑郁及動脈粥樣硬化等疾病也有著密切的關(guān)系。因此,TNFα已日益成為十分重要的生物標志物及藥物作用靶點。目前,應(yīng)用單克隆抗體阻斷TNFα與受體之間的相互作用已成為治療TNFα相關(guān)疾病的主要手段,例如英夫利昔單抗、賽妥珠單抗和阿達木單抗等。與這些傳統(tǒng)單克隆抗體相比,納米抗體不僅保持了高親和力和高特異性的特征,并具有體積小、熱穩(wěn)定性高、免疫原性低、化學操作性強和經(jīng)濟生產(chǎn)等方面的優(yōu)勢。前人通過噬菌體篩選技術(shù)獲得了羊駝抗體衍生的納米抗體VHH2,可以特異性識別TNFα并阻斷TNFα與其受體TNFR1和TNFR2的結(jié)合。該研究顯示VHH2在一定程度上具有作為藥物和檢測試劑的潛力。盡管... 

【文章頁數(shù)】：60 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 引言
    1.1 TNFα蛋白的概述
        1.1.1 TNFα的基因序列和蛋白結(jié)構(gòu)
        1.1.2 TNFα的生物體內(nèi)來源和分布
        1.1.3 TNFα的信號轉(zhuǎn)導和生物學功能
            1.1.3.1 TNFR1依賴的信號通路
            1.1.3.2 TNFR2依賴的信號通路
        1.1.4 TNFα相關(guān)的疾病
            1.1.4.1 TNFα與糖尿病的關(guān)聯(lián)
            1.1.4.2 TNFα與自免疫疾病的關(guān)聯(lián)
            1.1.4.3 TNFα與腫瘤的關(guān)聯(lián)
    1.2 TNFα的生物物理檢測方法
    1.3 新型光纖表面等離子體共振傳感器(FO-SPR)
    1.4 研究目的與意義
第2章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗菌株及質(zhì)粒
        2.1.2 主要實驗試劑和耗材
        2.1.3 主要實驗儀器
        2.1.4 實驗室常用溶液配制
            2.1.4.1 蛋白表達所需溶液
            2.1.4.2 蛋白純化所需溶液
            2.1.4.3 SDS-PAGE電泳緩沖液
            2.1.4.4 ELISA實驗所需溶液
    2.2 實驗方法
        2.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.2.1.1 p GEX4T-1-TNFα的構(gòu)建
            2.2.1.2 納米抗體p ET22b-VHH2/VHH2B/V2CC的構(gòu)建
        2.2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
        2.2.3 蛋白的誘導及表達
        2.2.4 蛋白的純化
            2.2.4.1 TNFα的純化
            2.2.4.2 納米抗體的純化
        2.2.5 Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度
        2.2.6 ELISA實驗測定TNFα與納米抗體VHH2、VHH2B及 V2CC的親和力
        2.2.7 FO-SPR傳感器的構(gòu)造及傳感系統(tǒng)
            2.2.7.1 FO-SPR傳感器的構(gòu)造
            2.2.7.2 FO-SPR傳感器的傳感系統(tǒng)
        2.2.8 FO-SPR傳感器的生物修飾及檢測過程
            2.2.8.1 修飾前傳感器的篩選
            2.2.8.2 納米抗體的定向固定
            2.2.8.3 傳感器的生物修飾過程
            2.2.8.4 傳感器的檢測過程
第3章 結(jié)果
    3.1 TNFα的實驗結(jié)果
        3.1.1 TNFα的基因克隆序列結(jié)果
            3.1.1.1 TNFα蛋白序列
            3.1.1.2 密碼子優(yōu)化及DNA序列
            3.1.1.3 合成重組質(zhì)粒的酶切驗證
            3.1.1.4 合成重組質(zhì)粒的測序驗證
        3.1.2 TNFα的鎳柱純化
    3.2 納米抗體VHH2、VHH2B及 V2CC的實驗結(jié)果
        3.2.1 VHH2、VHH2B及 V2CC的蛋白序列設(shè)計及合成結(jié)果如下:
        3.2.2 VHH2、VHH2B及 V2CC的純化
    3.3 ELISA驗證TNFα與 VHH2、VHH2B和 V2CC的相互作用
    3.4 FO-SPR傳感器的性能檢測
    3.5 納米抗體VHH2 修飾FO-SPR傳感器的最佳濃度
    3.6 VHH2、VHH2B或 V2CC修飾的FO-SPR傳感器對TNFα的親和力比較
    3.7 VHH2 修飾的FO-SPR傳感器特異性檢測TNFα的能力
第4章 結(jié)論
參考文獻
《指導教師對學位論文的學術(shù)評語》
《學位論文答辯委員會決議書》
附錄
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]Molecular mechanism of action of anti-tumor necrosis factor antibodies in inflammatory bowel diseases[J]. Ulrike Billmeier,Walburga Dieterich,Markus F Neurath,Raja Atreya.  World Journal of Gastroenterology. 2016(42)



本文編號：3680601