發(fā)布時(shí)間：2022-01-12 06:12

　　ATP作為一種高能磷酸化合物廣泛存在于各種生物體內(nèi),參與各項(xiàng)重要的生理生化活動(dòng)。實(shí)現(xiàn)對(duì)于ATP的檢測(cè)將會(huì)對(duì)我們研究各項(xiàng)生命活動(dòng)提供極大的幫助。目前針對(duì)ATP的檢測(cè)方法已經(jīng)開展了很多研究,對(duì)于檢測(cè)傳感器的靈敏度,檢測(cè)的速度等各方面也提出了越來越高的要求。本論文基于核酸自組裝結(jié)構(gòu),構(gòu)建了利用電化學(xué)以及適配體進(jìn)行ATP高靈敏快速檢測(cè)的生物傳感器。本實(shí)驗(yàn)是利用當(dāng)ATP存在時(shí),四面體結(jié)構(gòu)會(huì)對(duì)其產(chǎn)生響應(yīng)從而發(fā)生構(gòu)型變化形成G-四鏈體,通過電化學(xué)平臺(tái)將這種變化轉(zhuǎn)化為電信號(hào)實(shí)現(xiàn)對(duì)ATP的高靈敏檢測(cè)。首先利用四條經(jīng)過設(shè)計(jì)的序列進(jìn)行四面體結(jié)構(gòu)的合成,其中兩條序列一條設(shè)計(jì)有ATP適配體,另一條設(shè)計(jì)有用于信號(hào)產(chǎn)生的G-四鏈體的兩部分序列。然后將電極與靶標(biāo)分子ATP以及血紅素在一起孵育反應(yīng)。當(dāng)ATP存在時(shí),一方面適配體與ATP結(jié)合從而使適配體發(fā)生形變,從而縮短四面體兩個(gè)端點(diǎn)的距離。另一方面設(shè)計(jì)有G-四鏈體部分序列的兩端由于距離縮小從而形成G-四鏈體,由于血紅素進(jìn)入形成復(fù)合物從而引起電極表面的電阻發(fā)生變化。通過差分脈沖伏安法（DPV）可以觀察到有明顯的信號(hào)變化。而當(dāng)靶標(biāo)ATP不存在時(shí),由于G-四鏈體的兩部分序列距... 

【文章來源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：36 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

核酸自組裝原理圖

第三章結(jié)果與討論15第三章結(jié)果與討論3.1實(shí)驗(yàn)原理基于堿基互補(bǔ)配對(duì)和四面體結(jié)構(gòu)變化來檢測(cè)ATP的電化學(xué)傳感器的原理如圖3-1所示，首先合成了四條經(jīng)過精心設(shè)計(jì)的序列。在S1，S2，S3的5’端設(shè)計(jì)有巰基，每條序列將設(shè)計(jì)有3個(gè)主要部分與其余的三條鏈作用。適配體處于S3序列中部，G-四鏈體的兩部分處于S4的兩端。4條序列的顏色相同部分將會(huì)在95℃高溫變性和快速冷卻到4℃后通過堿基互補(bǔ)配對(duì)組合在一起構(gòu)成四面體的5條邊來用于穩(wěn)定四面體的結(jié)構(gòu)。在剩余的一條邊上設(shè)計(jì)有與ATP組合的適配體。在S3上適配體兩端和S4上的有兩段用于保證結(jié)構(gòu)變化的兩段淺綠色序列，在適配體與ATP結(jié)合時(shí)將會(huì)有助于G-四鏈體的兩部分結(jié)合。在S4的兩端設(shè)計(jì)G-四鏈體的12個(gè)G，按照9:3的比例分布在5’端和3’端。在經(jīng)過高溫變性和快速降溫之后，修飾有巰基的3個(gè)末端將會(huì)出現(xiàn)在四面體的3個(gè)角，幫助四面體固定在電極的表面，另外一個(gè)角與底邊上一個(gè)角為G-四鏈體的兩部分，在它們中間設(shè)計(jì)有ATP適配體。當(dāng)ATP不存在，適配體序列處于松弛狀態(tài)，G-四鏈體的兩部分距離較遠(yuǎn)不會(huì)相互結(jié)合，通過DPV檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn)信號(hào)基本不存在。而當(dāng)ATP存在時(shí)，ATP會(huì)與適配體相結(jié)合，從而引起結(jié)構(gòu)變化，使松弛的適配體變成緊張結(jié)構(gòu)，將G-四鏈體的兩部分拉近從而形成G-四鏈體。與此同時(shí)，加入的血紅素將會(huì)進(jìn)入G-四鏈體形成復(fù)合物從而造成電極表面的電阻增大。通過DPV檢測(cè)即可發(fā)現(xiàn)電流的明顯變化。圖3-1ATP檢測(cè)的電化學(xué)傳感器原理Fig.3-1PrincipleofanelectrochemicalsensorforthedetectionofATP3.2實(shí)驗(yàn)原理的驗(yàn)證為了驗(yàn)證四面體結(jié)構(gòu)的形成，在溶液中進(jìn)行了四面體與血紅素的結(jié)合試驗(yàn)，在四面

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文16體結(jié)構(gòu)形成之后，當(dāng)溶液中存在ATP時(shí)，G-四鏈體會(huì)形成，血紅素會(huì)進(jìn)入其中形成復(fù)合物，從而催化H2O2對(duì)ABTS的氧化產(chǎn)生綠色復(fù)合物。而當(dāng)ATP不存在時(shí)，G-四鏈體就不會(huì)形成，相應(yīng)的就不會(huì)產(chǎn)生綠色的復(fù)合物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3-2所示，對(duì)照組中的顏色要明顯比實(shí)驗(yàn)組中的顏色要淡，由此可見四面體在實(shí)驗(yàn)組中大量形成。比色實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3-1，發(fā)現(xiàn)空白的吸光值為0.255，實(shí)驗(yàn)組的吸光值平均值為0.733。對(duì)照組的吸光值要明顯低于實(shí)驗(yàn)組。這就說明四面體結(jié)構(gòu)在ATP的作用下大量形成。而在對(duì)照中仍有淡綠色，推測(cè)為當(dāng)ATP不存在時(shí)，首先仍會(huì)有少量的同一個(gè)四面體上的G-四鏈體會(huì)形成或者不同的四面體間的G-四鏈體兩部分發(fā)生作用形成結(jié)構(gòu)，其次還有可能為未參與形成四面體的冗余序列上的G-四鏈體兩部分通過組合形成了G-四鏈體。圖3-2四面體的定性試驗(yàn)Fig.3-2Qualitativetestoftetrahedron對(duì)照：不加入ATP；實(shí)驗(yàn)組1，實(shí)驗(yàn)組2和實(shí)驗(yàn)組3分別加入ATP100nmolL-1表3-1四面體加入ATP后的吸光值Table3-1TheabsorptionvalueofatetrahedronafteraddingATP對(duì)照123平均值吸光值（425nm）0.2550.6920.7460.7610.733進(jìn)一步驗(yàn)證四面體結(jié)構(gòu)是否形成，所以采用了聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）來表征序列的逐步結(jié)合。隨著序列的逐步結(jié)合，分子量會(huì)逐漸增大，所以在電泳圖上就會(huì)表現(xiàn)為階梯狀的結(jié)果。如圖3-3所示，泳道M為marker。泳道1為序列S1。泳道2在泳道1只有S1的基礎(chǔ)上添加S2，S1和S2通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合在一起，分子量增加，所處條帶要高于只有單獨(dú)S1存在時(shí)的條帶。同理，泳道3和泳道4的條帶也隨著序列的逐步加入逐步升高。通過電泳的結(jié)果就可以看出序列結(jié)合成功。當(dāng)然除了高亮的區(qū)域之外還存在部分拖帶的情況，這就可能為未參與形成G-四鏈體的冗余序?

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]三磷酸腺苷對(duì)人胃癌細(xì)胞惡性表型的去惡化作用[J]. 郝純毅,呂桂芝,蔡險(xiǎn)峰,林仲翔.  中華腫瘤雜志. 1999(03)



本文編號(hào)：3584256