本文關(guān)鍵詞：功能核酸用于環(huán)境及活細(xì)胞內(nèi)金屬離子的傳感與成像研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：金屬元素在整個(gè)生命體系中有雙重作用,一方面能維持動(dòng)植物的生命活動(dòng),另一方面也可能危害其健康。因此,研究環(huán)境中及生物體內(nèi)的金屬離子含量與分布,并對(duì)其進(jìn)行有效地檢測(cè),對(duì)于保護(hù)環(huán)境與人類(lèi)健康有積極意義。功能核酸是指具有特定生物功能,一般指能高特異性結(jié)合特定目標(biāo)物或具有某些催化功能的核酸分子。功能核酸探針在傳感方面具有一些獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：功能核酸可以通過(guò)指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化法(SELEX)篩選獲得,理論上任何目標(biāo)物均可篩到其對(duì)應(yīng)的功能核酸；已經(jīng)篩到的功能核酸可以通過(guò)合成獲得,適用于大批量生產(chǎn)；一些功能核酸,如左旋核酸(L-DNA)在生理環(huán)境下更穩(wěn)定,抗酶切降解效果更好,為活體金屬離子檢測(cè)提供了可行性；最后,功能核酸可以經(jīng)歷多次變性復(fù)性而不改變其活性,更易保存,減少了設(shè)備消耗。更重要的是,一些功能核酸對(duì)金屬離子表現(xiàn)出高度特異性,且響應(yīng)信號(hào)與金屬離子含量相關(guān),這為簡(jiǎn)單、方便、有效地檢測(cè)金屬離子提供了可能性。因此,利用功能核酸的優(yōu)點(diǎn),我們?cè)O(shè)計(jì)了一系列的生物傳感器用于檢測(cè)環(huán)境和生物體內(nèi)金屬離子。在第二章中,我們構(gòu)建了一種基于鉀離子傳感寡核苷酸(Potassium Sensing Oligonucleotide,簡(jiǎn)稱(chēng)PSO)的生物傳感器。首先用修飾有熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,簡(jiǎn)稱(chēng)FRET)報(bào)告基團(tuán)對(duì)的DNA鏈來(lái)優(yōu)化PSO的終端,以獲取更高的靈敏度,然后用DNA合成儀將二�；|(zhì)組裝到PSO鏈上。在有鉀離子出現(xiàn)時(shí),形成的G-四聚體構(gòu)型會(huì)使產(chǎn)生FRET效應(yīng)的兩種熒光基團(tuán)(FAM和TAMRA)對(duì)靠近,從而導(dǎo)致FRET效率發(fā)生改變。此外,隨著K+濃度的變化,熒光強(qiáng)度比率也是可逆的�；谶@個(gè)實(shí)驗(yàn)方案,我們?cè)诩?xì)胞膜上組裝了該傳感器,并第一次將其用于實(shí)時(shí)檢測(cè)細(xì)胞微環(huán)境中K+濃度的動(dòng)態(tài)變化。在第三章中,我們構(gòu)造了一種在均相溶液和活性細(xì)胞中的L型凝血酶結(jié)合適配體(L-type Thrombin Binding Aptame,簡(jiǎn)稱(chēng)L-TBA)K+傳感器,通過(guò)用可預(yù)測(cè)的L-TBA的優(yōu)點(diǎn),演示基于L-TBA的K+傳感器克服了天然D-PSO的缺陷,從而在活性細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)K+成像并且表現(xiàn)出精確,安全和生物正交PSO的優(yōu)點(diǎn)。在第四章中,我們基于Pb2+ DNAzymes,采用已報(bào)到的D-DNAzyme序列,根據(jù)L-DNAzyme與D-DNAzyme在存在非手性金屬離子輔因子時(shí)有類(lèi)似的催化活性,但在生物樣品中,L-DNAzyme還有額外的生物穩(wěn)定性的優(yōu)點(diǎn),設(shè)計(jì)了L-DNAzyme識(shí)別單元的生物傳感器并將其用在環(huán)境水體檢測(cè),如湘江水,和復(fù)雜生物環(huán)境中,如胎牛血清(Fetal bovine serum,簡(jiǎn)稱(chēng)FBS),來(lái)檢測(cè)Pb2+。目前,已篩選出的特異性識(shí)別各種離子的DNAzymes,很可能為針對(duì)靈敏性和選擇性而發(fā)展的檢測(cè)各種目標(biāo)物的新的基于L-DNAzyme的傳感系統(tǒng)在生物醫(yī)學(xué)和環(huán)境檢測(cè)領(lǐng)域提供更深一步的應(yīng)用。
【關(guān)鍵詞】：金屬離子檢測(cè) 功能核酸 G-四聚體 L-DNA L-DNAzyme
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：TP212.3
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 第1章 緒論11-22
• 1.1 金屬離子在生物體內(nèi)的作用11-12
• 1.2 目前檢測(cè)金屬離子的方法12-13
• 1.3 功能核酸在檢測(cè)金屬離子中的應(yīng)用13-20
• 1.3.1 功能核酸13-14
• 1.3.2 功能核酸種類(lèi)14-17
• 1.3.3 基于功能核酸的金屬離子傳感器17-20
• 1.4 本論文的研究工作20-22
• 第2章 固定在細(xì)胞膜上動(dòng)態(tài)檢測(cè)細(xì)胞微環(huán)境中鉀離子的生物傳感器22-32
• 2.1 引言22-23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)部分23-25
• 2.2.1 試劑與儀器23-24
• 2.2.2 DNA合成24
• 2.2.3 熒光檢測(cè)24-25
• 2.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)25
• 2.2.5 流式分析25
• 2.2.6 共聚焦成像25
• 2.3 結(jié)果與討論25-31
• 2.3.1 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化25-27
• 2.3.2 圓二色譜表征分析27-28
• 2.3.3 熒光檢測(cè)28-29
• 2.3.4 流式分析與共聚焦29-31
• 2.4 小結(jié)31-32
• 第3章 生物穩(wěn)定性的的L型G-四聚體用于細(xì)胞內(nèi)鉀離子傳感32-44
• 3.1 前言32-34
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分34-37
• 3.2.1 材料和試劑34
• 3.2.2 DNA合成34-36
• 3.2.3 熒光檢測(cè)36
• 3.2.4 凝膠電泳36
• 3.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)36
• 3.2.6 共聚焦成像36-37
• 3.2.7 流式分析37
• 3.2.8 細(xì)胞毒性研究37
• 3.3 結(jié)果與討論37-43
• 3.3.1 圓二色譜表征分析37-38
• 3.3.2 L-TBA探針在溶液中對(duì)K~+的檢測(cè)分析38-39
• 3.3.3 L-TBA的穩(wěn)定性分析39-41
• 3.3.4 L-TBA的毒性分析41-42
• 3.3.5 L-TBA對(duì)細(xì)胞內(nèi)K~+成像分析42-43
• 3.4 小結(jié)43-44
• 第4章 生物穩(wěn)定性的L-DNAzyme用于復(fù)雜實(shí)際樣品中鉛離子的檢測(cè)44-55
• 4.1 引言44-45
• 4.2 實(shí)驗(yàn)部分45-47
• 4.2.1 試劑與儀器45-46
• 4.2.2 DNA合成46
• 4.2.3 熒光檢測(cè)46
• 4.2.4 凝膠電泳46-47
• 4.3 結(jié)果與討論47-54
• 4.3.1 實(shí)驗(yàn)原理47-48
• 4.3.2 圓二色譜表征及對(duì)映體酶鏈的熱動(dòng)力學(xué)研究48
• 4.3.3 對(duì)映體酶的催化活性48-51
• 4.3.4 對(duì)映體酶的生物穩(wěn)定性51-52
• 4.3.5 L-DNAzymes在實(shí)際樣品中的性能52-54
• 4.4 小結(jié)54-55
• 結(jié)論55-57
• 參考文獻(xiàn)57-72
• 附錄A 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄72-73
• 致謝73

  本文關(guān)鍵詞：功能核酸用于環(huán)境及活細(xì)胞內(nèi)金屬離子的傳感與成像研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：279676