發(fā)布時間：2020-03-25 18:53

【摘要】：保障食品安全和維護(hù)人類健康是當(dāng)前熱門的兩個話題,其中食源性致病菌污染導(dǎo)致食品安全事件頻發(fā),嚴(yán)重影響了我國經(jīng)濟(jì)正常發(fā)展和公眾健康,因此建立高靈敏檢測方法是降低食源性致病菌污染風(fēng)險和預(yù)防感染的迫切需要。食源性致病菌毒力基因可提供致病菌毒性以及特定的遺傳信息,識別致病性基因是識別樣品中食源性致病菌污染的重要環(huán)節(jié)。本研究擬以食源性致病菌毒力基因和miRNAs為對象,納米金為基礎(chǔ),制備不同形貌和性能的金納米材料及其組裝體,通過表面修飾使其具有良好的生物相容性,借助其特殊的光學(xué)效應(yīng)以及良好的導(dǎo)電性,構(gòu)建一系列光學(xué)信號增強(qiáng)或者電信號增強(qiáng)的納米核酸傳感器,建立簡單、安全、可視化的生物傳感檢測新方法,用于快速靈敏地檢測食源性致病菌毒力基因,并實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)毒性生物標(biāo)志物miRNAs高靈敏檢測及可視化,為實(shí)現(xiàn)食源性致病菌快速檢測以及胞內(nèi)miRNAs的高效識別奠定基礎(chǔ);基于宿主細(xì)胞內(nèi)miRNAs的表達(dá)量與食源性致病菌污染劑量的關(guān)系,也為建立以敏感細(xì)胞為模型早期篩查食品中潛在致病菌的方法提供新的思路。1.不同縱橫比的金銀核殼納米棒(Gold@silver nanorods,Au@Ag NRs)的可控合成。采用種子生長法制備了不同縱橫比的Au@Ag NRs,確定合成過程中硝酸銀、抗壞血酸和金納米棒的最佳加入量。通過調(diào)控pH值,結(jié)合紫外可見光光譜儀、透射電子顯微鏡、X射線衍射儀探討Au@Ag NRs的生長機(jī)理。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示pH值調(diào)控表面活性劑CTAB吸附在金納米棒(Gold nanorods,AuNRs)晶面的位置和速率,從而調(diào)控Ag~0吸附在AuNRs表面的位置,由此制備了不同大小和形狀的Au@Ag NRs,為下一階段利用Au@Ag NRs物理化學(xué)性質(zhì)構(gòu)建生物傳感器奠定基礎(chǔ)。2.基于金銀核殼納米棒表面增強(qiáng)熒光(Surface enhanced fluorescence,SEF)傳感器的構(gòu)建。以不同縱橫比的金納米棒為核制備Au@Ag NRs,通過對Au@Ag NRs表面修飾莖環(huán)探針和熒光團(tuán)分子Cy3,構(gòu)建Au@Ag NRs表面增強(qiáng)熒光的“ON-OFF”核酸傳感器,實(shí)現(xiàn)熒光檢測大腸桿菌O157:H7毒力基因eae A。對影響傳感器中熒光團(tuán)分子Cy3熒光強(qiáng)度的因素進(jìn)行考察發(fā)現(xiàn),當(dāng)選擇金銀核殼納米長棒,Cy3分子與Au@Ag NRs表面之間的距離為10 nm時,Au@Ag NRs表面增強(qiáng)熒光團(tuán)分子Cy3的熒光強(qiáng)度效果最強(qiáng),有利于提高檢測的靈敏度。當(dāng)eae A基因濃度在1×10~(-17)-1×10~(-11) mol/L之間時,Cy3熒光團(tuán)分子的熒光強(qiáng)度與大腸桿菌O157:H7基因eae A濃度的對數(shù)值呈線性關(guān)系,線性回歸方程為y=95.97 x+1992(R~2=0.9947),最低檢出限為3.33×10~-1818 mol/L。構(gòu)建的熒光增強(qiáng)核酸傳感器也表現(xiàn)出良好的特異性和重復(fù)性,可以區(qū)分堿基錯配序列,回收率在98.36%-101.67%之間。3.基于金納米十字@二硫化鉬(Gold nanocrosses@molybdenum disulfide,AuNCs@MoS_2)異源二聚體增強(qiáng)電化學(xué)信號便攜式傳感器的構(gòu)建。為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)快速、靈敏、現(xiàn)場檢測食源性致病菌,將AuNCs@MoS_2異源二聚體修飾在絲網(wǎng)印刷電極(Screen printed electrode,SPE)上,建立了便攜式電化學(xué)傳感器檢測大腸桿菌O157:H7毒力基因eae A。目的基因eae A引發(fā)由toehold介導(dǎo)的DNA鏈置換反應(yīng)獲得雙鏈DNA H_1/H_2,該雙鏈DNA與AuNCs@MoS_2/SPE上的cDNA結(jié)合,在[Ru(NH_3)_6]~(3+)分子存在的情況下,引起電化學(xué)信號變化,從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的定量檢測。通過toehold介導(dǎo)的DNA鏈置換反應(yīng)、選擇AuNCs@MoS_2修飾電極表面增強(qiáng)電化學(xué)信號,大大提高了檢測的靈敏度,當(dāng)eae A濃度在1-10~5 amol/L之間時,其與電流的差值呈線性相關(guān),線性方程為ΔI(μA)=1.61 log[C_(eae A)(amol/L)]+2.02(R~2=0.9974),最低檢出限為0.096 amol/L。構(gòu)建的傳感器特異性良好,可以區(qū)分單堿基錯配序列。4.基于金納米棒-金納米十字(Gold nanorod-gold nanocross,AuNR-AuNC)“FRET-SEF”熒光信號增強(qiáng)檢測miRNAs探針的構(gòu)建及其胞內(nèi)成像。為實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)毒性評價這一目標(biāo),進(jìn)一步構(gòu)建了新型一對一組裝的AuNR-AuNC二聚體“FRET-SEF”核酸探針,以“OFF-enhanced ON”熒光增強(qiáng)開關(guān)檢測胞外胞內(nèi)生物標(biāo)志物miRNAs。AuNC與Cy5熒光團(tuán)分子之間10 nm的距離,有利于AuNC表面增強(qiáng)Cy5的熒光強(qiáng)度,AuNC與AuNR的側(cè)面組裝,有利于AuNR對Cy5分子的熒光共振能量轉(zhuǎn)移,將AuNC與AuNR巧妙結(jié)合構(gòu)建AuNR-AuNC二聚體,充分利用二聚體產(chǎn)生的熒光增強(qiáng)效應(yīng),大大提高了檢測的靈敏度。當(dāng)miRNA-21的濃度分別在0.0006-0.0016 fmol/L和0.1-100 fmol/L范圍內(nèi)時,線性方程分別為F=1830.32 logC+6349.27(R~2=0.9901)和F=244.41 logC+1916.10(R~2=0.9984),檢出限可達(dá)0.5 amol/L和0.03 fmol/L,由此證明構(gòu)建的AuNR-AuNC二聚體探針可精確測定生物標(biāo)志物miRNA。此外,構(gòu)建的AuNR-AuNC二聚體探針具有較好的穩(wěn)定性和低毒性,實(shí)現(xiàn)了胞內(nèi)檢測Hep G2細(xì)胞生物標(biāo)志物miRNA-21,構(gòu)建的AuNR-AuNC二聚體探針也初步實(shí)現(xiàn)了以敏感細(xì)胞為模型評價食源性致病菌毒力因子等外源危害的毒性水平。5.基于FDTD Solutions模擬及金納米花@石墨烯量子點(diǎn)(Gold nanoflower@graphene quantum dots,AuNF@GQDs)構(gòu)建彗星式異源二聚體增敏探針實(shí)現(xiàn)miRNA-34a的檢測和體內(nèi)成像。為實(shí)現(xiàn)體內(nèi)毒性評價,構(gòu)建了低毒性彗星式異源二聚體AuNF@GQDs增敏探針,以toehold誘導(dǎo)目標(biāo)鏈miRNA引發(fā)的從熒光信號FRET“off”到DNA循環(huán)“on”模式的DNA增敏鏈置換反應(yīng),識別體內(nèi)體外miRNA-34a的表達(dá)量,評估細(xì)胞的老化程度。根據(jù)FDTD Solutions計算模擬AuNF與GQDs之間距離為4 nm時,AuNF對GQDs有很強(qiáng)的FRET效應(yīng),可縮短響應(yīng)時間,增強(qiáng)消光效率,有利于提高檢測的靈敏度。MiRNA-34a濃度在0.4-4 fmol/L時,線性方程為Y=1963 x+213,R~2=0.9921,檢出限為0.1 fmol/L,且該探針特異性好,可以區(qū)分一個堿基錯配序列。該低毒性探針同樣也應(yīng)用于生長因子TGF-β1誘導(dǎo)后的大鼠心肌細(xì)胞(H9C2)原位成像和檢測miRNA-34a的表達(dá)量,當(dāng)TGF-β1濃度在5-500 ng/mL之間時,胞內(nèi)熒光強(qiáng)度與TGF-β1濃度的對數(shù)值呈線性相關(guān),線性方程為y=1.37 x+1.04,R~2=0.9330。此外,構(gòu)建的二聚體AuNF@GQDs增敏探針注射入12月齡的C57BL/6J小鼠左心室中體內(nèi)檢測miRNA-34a,成功用于評價小鼠心臟的老化程度,且該探針對小鼠沒有負(fù)面毒性效應(yīng)。總之,本論文構(gòu)建的具有各向異性的金銀核殼納米棒以及納米二聚體增強(qiáng)型核酸探針,通過設(shè)計探針的形貌和空間分布,發(fā)現(xiàn)熒光和電化學(xué)增強(qiáng)機(jī)制,應(yīng)用于食源性致病菌毒力基因的高靈敏檢測,對建立通過監(jiān)測食源性致病菌浸染體內(nèi)引起效應(yīng)生物標(biāo)志物表達(dá)水平的變化,從而評估食源性致病菌的毒性和宿主受感染的程度具有重要意義。
【圖文】：

圖 1-2 聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)（PCR）原理圖Fig.1-2 Outline of the processes involved in the polymerase chain reaction (PCR)由于 PCR 構(gòu)建的方法需要設(shè)計待測致病菌對應(yīng)的探針，，同時標(biāo)記同位素以及熒光昂貴，為使這些缺點(diǎn)最小化，需要開發(fā)新型的成本可控且響應(yīng)迅速的檢測方法，并

圖 1-3 構(gòu)建選擇性識別致病菌納米探針原理圖atic representation showing the fabrication of recognition elements o病菌及其毒力基因檢測的納米材料通常包括金納Ps）、金納米棒（Gold nanorods，AuNRs）、磁納米
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS207.4;TP212;O657.1

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本文編號：2600293