【摘要】：一氧化氮(NO)是一種單電子自由基,能自由地在生物膜體系中擴散,在生物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物有N_2O_3、HNO、NO_2~-、NO_3~-,并且與O_2~(?-)反應(yīng)生成過氧亞硝基陰離子(ONOO~-)。NO通過與細胞中金屬蛋白質(zhì),自由基,蛋白質(zhì)硫醇反應(yīng),調(diào)節(jié)細胞正常的生理功能。而ONOO~-通過氧化和硝化氨基酸,調(diào)節(jié)細胞正常的生理功能。因此,NO與ONOO~-成為生物體內(nèi)重要的信號分子。熒光探針近年來成為NO和ONOO~-重要的檢測工具,雖然已經(jīng)報道了許多類型的NO與ONOO~-熒光探針,但其中也有不足之處。本論文從改變反應(yīng)機理入手,設(shè)計合成了一系列新反應(yīng)類型的NO,ONOO~-熒光探針,展開了以下工作:(1)我們首次創(chuàng)建了芳香二級胺與NO的亞硝化一步反應(yīng)的設(shè)計策略。開發(fā)了以BODIPY為熒光團,N-芐基-4-羥基苯胺為識別基團的NO熒光探針2.1,并在2.1的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上引入三苯基磷正鹽(TPP)開發(fā)了能靶向線粒體的NO熒光探針2.2。探針2.1與NO簡單的一步反應(yīng),以及羥基取代基的供電子能力,使該反應(yīng)在數(shù)秒內(nèi)完成,并且在與GSH,Hcy,Cys大量存在下,沒有干擾與NO反應(yīng)后的熒光信號,從而解決了探針響應(yīng)速度的問題。通過吸收光譜和熒光發(fā)射光譜證明了探針2.1沒有與其它ROS(ClO~-、H_2O_2,、O_2~(?-)、~1O_2和~?OH)發(fā)生化學(xué)反應(yīng),并且對于探針2.1與高活性的ClO~-,我們通過LC-MS分析,更加明確了兩者沒有發(fā)生反應(yīng)。而且由于探針2.1結(jié)構(gòu)以及與NO識別機理的原因,避免了DHA/AA/MGO的干擾。因此我們既解決了探針識別NO的熒光選擇性問題,又解決了生物體系中潛在消耗探針的問題。通過探針2.1對NO的滴定,我們計算出2.1的檢出限低至4 nM。2.2同樣表現(xiàn)出識別NO速度快,專一性強,并且與商業(yè)化的線粒體探針進行了共定位,皮爾森系數(shù)高達0.92。探針2.1與2.2分別影像了HeLa細胞與RAW 264.7細胞中外源性和內(nèi)源性的NO。(2)我們首次創(chuàng)建了芳香三級胺與ONOO~-生成相應(yīng)的N-亞硝基,氮-氧化合物的設(shè)計策略,開發(fā)了以BODIPY為熒光團,N,N-二芐基-4-甲氧基苯胺為識別基團的ONOO~-熒光探針3.1,并在3.1的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上引入TPP開發(fā)了能靶向線粒體的ONOO~-熒光探針Mito-3.1,并引入嗎啡啉,首次開發(fā)了能靶向溶酶體的ONOO~-熒光探針Lyso-3.1。探針3.1與ONOO~-的特異性反應(yīng)以及甲氧基的供電子能力,使該探針能在數(shù)秒內(nèi)完成反應(yīng),并且在1 mM二氧化碳與3.1共存下,沒有干擾探針與ONOO~-的熒光信號,從而解決了探針響應(yīng)速度的問題。通過吸收光譜與熒光光譜,證明了3.1沒有與其它ROS(ClO~-、H_2O_2、O_2~(?-),、~1O_2,~?OH)發(fā)生反應(yīng),而且與其它ROS共存下,沒有干擾探針3.1與ONOO~-反應(yīng)后的熒光信號。以上解決了探針識別ONOO~-熒光選擇性的問題以及生物體系中潛在消耗探針的問題。通過3.1對ONOO~-的滴定,計算出3.1的檢出限低至0.15 nM。Mito-3.1,Lyso-3.1與3.1相似識別ONOO~-速度快,專一性好,并且分別與商業(yè)化的線粒體探針和溶酶體探針共定位,皮爾森系數(shù)分別為0.92,0.84。探針3.1,Mito-3.1,Lyso-3.1分別影像了HeLa細胞,RAW264.7細胞中外源性和內(nèi)源性的ONOO~-,并且3.1首次被應(yīng)用于檢測糖尿病老鼠模型中的ONOO~-(腎切片,肝切片)。(3)我們利用已創(chuàng)建的芳香三級胺與ONOO~-特異性反應(yīng)策略和PeT熒光開關(guān)機理,開發(fā)了以水溶性好,光穩(wěn)定性強的硅羅丹明為熒光團,N,N-二芐基-4-甲氧基苯胺為識別基團的ONOO~-近紅外熒光探針4.1。4.1繼承了3.1的優(yōu)異性質(zhì),與ONOO~-在數(shù)秒內(nèi)完成反應(yīng),不受其它ROS(ClO~-、H_2O_2、O_2~(?-)、~1O_2,~?OH)的干擾。并且4.1與二氧化碳共存下,沒有干擾4.1與ONOO~-反應(yīng)后的熒光信號。檢出限低至3 nM。4.1在HeLa細胞中用激光照射60分鐘,沒有引起任何的熒光強度,表明4.1抗光氧化能力強。4.1與ONOO~-在細胞中反應(yīng)后用激光照射60分鐘,熒光強度基本沒有衰減,表明產(chǎn)物抗光漂白能力強。這些性質(zhì)達到了長時間影像ONOO~-的要求。探針4.1分別在HeLa細胞和RAW 264.7細胞中影像了外源性和內(nèi)源性的ONOO~-,而且影像了STZ刺激胰島β-細胞及糖尿病老鼠模型中的ONOO~-(活體/腎切片/肝切片),同時評估了苯酚類抗氧化藥物對內(nèi)皮細胞EA.hy926缺血再灌注模型的治療效果。
【圖文】：

子熒光探針適用于研究生命過程，生物疾病，而且已經(jīng)成為生命及藥物的設(shè)計，篩選等領(lǐng)域必不可少的研究工具。設(shè)計合成能特的熒光探針和運用生物成像技術(shù)挖掘熒光探針在生物研究方面的未知的生命活動，依然是前沿交叉研究領(lǐng)域的熱點。原理的簡介是一種光致發(fā)光的冷光現(xiàn)象。如圖 1.1 所示[1]，熒光物質(zhì)吸收合適子從基態(tài)（S0）躍遷到激發(fā)態(tài)，處于高能量激發(fā)態(tài)的電子通過非（VT）和內(nèi)轉(zhuǎn)化（IC）的方式回到第一單重激發(fā)態(tài)（S1），，然后通光子回到基態(tài)（S0），發(fā)射的光子叫做熒光。同樣也是一種光致冷發(fā)光現(xiàn)象。磷光物質(zhì)吸收合適能量的光子，電遷到激發(fā)態(tài)，處于高能量激發(fā)態(tài)的電子通過非輻射躍遷系間竄越（發(fā)三重態(tài)（T1），再經(jīng)過振動弛豫（VT）回到最低能級的第一激發(fā)三重躍遷釋放光子回到基態(tài)（S0），這種發(fā)光叫磷光。

圖 1.3 探針分子與分析底物作用示意圖。是探針分子與目標(biāo)分子之間發(fā)生的弱相互作用，根據(jù)文獻的報導(dǎo)電引力、范德華力、配位鍵、氫鍵，偶極-偶極相互作用力等。改變探針分子的性能（波長、強度、熒光壽命），是最開始熒光[25]。這類探針的優(yōu)點是探針分子與目標(biāo)化合物之間的相互作用測生物目標(biāo)分子的動態(tài)變化。但此類熒光探針普遍不靈敏，不體系的極性改變會導(dǎo)致弱相互作用發(fā)生很大變化，尤其是在水位鍵等作用會變得很弱，導(dǎo)致該類型熒光探針的靈敏度不高。則是利用探針分子與目標(biāo)分子發(fā)生溫和的化學(xué)反應(yīng)，即反應(yīng)型相互作用可以改變探針分子取代基的供-拉電子能力和探針結(jié)構(gòu)螺環(huán)的開關(guān)環(huán)等，使探針體系的熒光性能發(fā)生改變，從而達到的[7-12]。這類探針的優(yōu)點是探針與目標(biāo)分子發(fā)生不可逆的化學(xué)變熒光強度得到充分的積累，提高了熒光探針的靈敏度。但缺點
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：O657.3;TP212.3

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本文編號：2598754