發(fā)布時間：2019-11-19 16:00

【摘要】：核酸適配體(Aptamer)是利用配體指數(shù)富集的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment, SELEX)篩選得到的寡核苷酸片段,可以是單鏈DNA(single-stranded DNA,ssDNA)或者RNA。它可以與蛋白質(zhì)或其他物質(zhì)特異性結(jié)合,具有高選擇性和高親和力,具有比抗體更加穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì),此外還具有低毒性、無免疫原性等優(yōu)點,這使得核酸適配體在蛋白檢測過程中有很大優(yōu)勢。通過SELEX技術(shù)可以簡單快速得到高選擇性和高親和力的核酸適配體,在疾病的診斷和治療中具有很廣闊的前景。胃泌素釋放肽前體 31-98 片段(Progastrin-releasing peptide 31-98,ProGRP31-98)是一種高度可靠的、特異性的、靈敏的小細(xì)胞肺癌(Small Cell Lung Cancer, SCLC)腫瘤標(biāo)志物。血清中ProGRP31-98水平的測定使得對小細(xì)胞肺癌的診斷、預(yù)后預(yù)測及治療監(jiān)測成為可能。對ProGRP31-98水平的檢測主要是利用酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA)、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)(CLIA)等免疫學(xué)方法。目前還沒有針對ProGRP31-98的核酸適配體被篩選出來,而本實驗室利用SELEX技術(shù)篩選得到了 8條針對ProGRP31-98的核酸適配體序列。針對這些序列,我們從中選擇出了特異性較強的核酸適配體,以一種DNA分子光開光化合物[Ru(bpy)2dppz]2+為探針,構(gòu)建了一種無標(biāo)記的電化學(xué)發(fā)光方法對核酸適配體的特異性進(jìn)行檢測,得到了一條89nt的ProGRP31-98核酸適配體以及它的隨機區(qū)域(48 nt)的核酸適配體�；诘玫降膬蓷l核酸適配體的二級結(jié)構(gòu),得到了另外兩條經(jīng)過截短的40 nt和15 nt的核酸適配體,這些核酸適配體與ProGRP31-98具有很強的親和力,解離常數(shù)最低至16nM。利用無標(biāo)記的電化學(xué)發(fā)光法可測得的最低檢測極限為17 nM。由于血清中ProGRP31-98水平很低,這種無標(biāo)記的電化學(xué)發(fā)光測定法的靈敏度不足夠高。為了得到更加靈敏的檢測,我們設(shè)計了一種電化學(xué)核酸適配體傳感器。首先將3-疏基丙酸(3-MPA)通過金-硫鍵自組裝到金電極表面,經(jīng)1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)/N-羥基硫代琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)活化表面羧基后固定鏈霉親和素;再在核酸適配體兩端分別修飾上巰基及生物素,誘導(dǎo)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)后與另一種巰基修飾的發(fā)夾DNA (hairpin DNA)共同連接到金納米顆粒上形成雙發(fā)夾DNA修飾的納米金復(fù)合物(hpDNA-AuNPs-Aptamer),該復(fù)合物作為信號放大元件,與ProGRP31-98孵育后導(dǎo)致核酸適配體結(jié)構(gòu)改變使得生物素暴露,與鏈霉親和素結(jié)合后連接到電極表面;再通過線性掃描(LSV)的方法將雙功能電化學(xué)指示劑[Ru(NH3)5L]2+嵌入到納米金復(fù)合物上的發(fā)夾DNA中,利用差分脈沖伏安法(DPV)測得釕(Ⅱ)的氧化電流信號,其中L為3- (2-菲-9-甲基-乙烯基)吡啶,能夠嵌入到雙鏈DNA分子,釕(Ⅱ)為氧化還原中心。我們對該傳感器電極組裝過程進(jìn)行了表征并對初步的檢測性能進(jìn)行研究,對部分條件進(jìn)行了優(yōu)化。
【圖文】：

進(jìn)一步的研究證明。逡逑１．１．２核酸適配體篩選方法簡介逡逑基本的ＳＥＬＥＸ技術(shù)的思想如圖１．１所示：首先在體外化學(xué)合成一個單鏈寡逡逑核苷酸文庫，此文庫兩端為帶有限制性內(nèi)切酶位點的固定序列，是ＰＣＲ反應(yīng)及逡逑其它酶反應(yīng)相關(guān)引物的結(jié)合位點，中間為隨機序列，由ｎ個堿基組成，此時文逡逑庫的庫容量為４ｎ，邋ｎ—般在２５－６０之間［１７］。寡核苷酸文庫可以是ＤＮＡ文庫，，也逡逑可以是ＲＮＡ文庫，還可以是經(jīng)修飾化的ＲＮＡ文庫。通常這些文庫的容量有逡逑１0１４－１0１５個單鏈寡核苷酸序列，與靶物質(zhì)混合后，文庫中與靶物質(zhì)特異性識別的逡逑寡核苷酸就形成核酸－耙物質(zhì)復(fù)合物，此時與靶物質(zhì)相結(jié)合的寡核苷酸豐度較低。逡逑通過清洗除去多余核酸，再分離出和靶物質(zhì)相結(jié)合的核酸分子，用該核酸分子逡逑作為模板進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增

下面以鏈霉親和素磁珠的包被為例：逡逑１）清洗磁珠：將購買的ＳＭ３－Ｐ１００氧化硅羧基磁珠（１０邋ｍｇ／ｍＬ）混勻后，取逡逑２００ｆｉＬ邋（ｇｐ２ｍｇ）加入到邋１．５ｍＬＥＰ邋管中，用邋ＭＥＳＴ邋（ｐＨ６．０）洗滌兩次，逡逑經(jīng)磁力架分離后去除上清。逡逑２）羧基磁珠的活化：由于ＥＤＣ容易水解，所以需要新鮮配制。稱�。欤恚纾恚兀哄义先芙庥冢玻埃板澹酰蹋停牛渝澹ǎ穑儒澹叮埃┲�，加入到清洗好的磁珠中，渦旋后將ＥＰ管逡逑放入分子雜交儀內(nèi)，３７°Ｃ活化１邋ｈ；再稱�。保瑰澹恚珏澹螅酰欤妫铮危龋�，溶解于２００邋ｎＬ逡逑ＭＥＳ邋（ｐＨ６．０）中，加入到上述ＥＰ管內(nèi)，混勻后繼續(xù)反應(yīng)ｌｈ。逡逑３）鏈霉親和素與磁珠的偶聯(lián)：經(jīng)活化后，磁分離去除上清液，磁珠用ＭＥＳ邋（ｐＨ逡逑９．０）清洗兩次，加入５０邋ｎＬ邋ｌｍｇ／ｍＬ鏈霉親和素溶液，再加入４５０邋ｎＬ邋ＭＥＳ逡逑（ｐＨ邋９．０）使總體積為５００邋ｎＬ，混勻后于分子雜交儀內(nèi)３０°Ｃ過夜偶聯(lián)。逡逑４）鏈霉親和素磁珠的保存：偶聯(lián)好的磁珠經(jīng)磁分離后，用ＰＢＳ邋（ｐＨ邋７．４）清洗逡逑一次，重懸于１邋ｍＬ邋ＰＢＳ邋（ｐＨ邋７．４），最終得到１邋ｍｇ／ｍＬ鏈霉親和素包被磁逡逑珠，保存在４°Ｃ冰箱內(nèi)備用。逡逑牛胰島素磁珠、牛血清白蛋白磁珠、胃泌素釋放肽前體３１－９８片段磁珠包被逡逑
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q789;TP212

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2563136