本文關(guān)鍵詞：基于納米金顆粒的高靈敏適配體傳感器的構(gòu)建及其在真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用

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【摘要】：真菌毒素是一類具有極強(qiáng)毒性的真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物,廣泛存在于各類食物及飼料中,嚴(yán)重危害著人類和動(dòng)物的生命安全與健康。目前,高效液相層析法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析法在真菌毒素分析檢測(cè)中應(yīng)用最為廣泛,這兩種方法雖然具有很好的靈敏度和較低的最低檢出限(LOD),但是需要昂貴的儀器設(shè)備、繁瑣的操作流程、專業(yè)的技術(shù)人員等,嚴(yán)重制約了它們?cè)谑称啡粘z測(cè)中的應(yīng)用。為了獲得便捷高效、高靈敏度、高特異性、成本低廉的真菌毒素檢測(cè)技術(shù),科研工作者們提出了多種解決方案,其中包括應(yīng)用納米粒子對(duì)能夠識(shí)別待測(cè)毒素的抗體或是適配體進(jìn)行標(biāo)記,通過多種檢測(cè)手段,實(shí)現(xiàn)對(duì)真菌毒素的檢測(cè)。然而現(xiàn)有的檢測(cè)方法很難滿足在保有一個(gè)較寬檢測(cè)范圍的同時(shí),獲得一個(gè)極低的檢出限。為應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn),本課題設(shè)計(jì)開發(fā)了兩種基于納米金的適配體傳感器,通過優(yōu)化設(shè)計(jì)思路,充分發(fā)揮納米材料及核酸適配體所具備的特性,實(shí)現(xiàn)對(duì)真菌毒素的快速、靈敏、低成本的檢測(cè)。本課題的主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:1.基于納米金構(gòu)建用于AFB1檢測(cè)的適配體傳感器納米金膠體在520nm左右有一特征吸收峰。本實(shí)驗(yàn)通過將AFB1核酸適配體修飾于納米金表面來獲得探針。檢測(cè)時(shí),預(yù)先將待測(cè)液與一定濃度的AFB1-BSA混合,然后將上述納米金探針加入該混合體系。若待測(cè)液中沒有AFB1,納米金表面的AFB1適配體則會(huì)與BSA上的AFB1特異性結(jié)合,由于一個(gè)BSA分子上標(biāo)記有多個(gè)AFB1,從而引發(fā)納米金聚沉現(xiàn)象,納米金在特征峰處吸收強(qiáng)度下降。反之,待測(cè)液中的游離AFB1會(huì)與BSA-AFB1形成競(jìng)爭,抑制納米金聚沉和特征吸收峰的降低。本體系中,根據(jù)納米金的特征峰吸收與待測(cè)AFB1濃度的相關(guān)性,實(shí)現(xiàn)對(duì)未知濃度的AFB1的檢測(cè)。線性檢測(cè)范圍為10 pg m L-1至1μg m L-1,最低檢測(cè)限為4.1 pg m L-1。2.基于FRET現(xiàn)象構(gòu)建高靈敏OTA適配體傳感器FRET適配體傳感器包括一個(gè)未經(jīng)修飾的OTA適配體作為識(shí)別探針,OTA適配體部分互補(bǔ)鏈修飾的金納米粒子(互補(bǔ)鏈末端修飾有生物素,生物素-互補(bǔ)DNA-金納米粒子)作為能量受體,和一個(gè)經(jīng)Cy3標(biāo)記的鏈霉親和素作為能量供體。該適配體傳感器用于檢測(cè)OTA時(shí),適配體與其互補(bǔ)鏈分離,與OTA特異性結(jié)合,修飾于互補(bǔ)鏈末端的生物素暴露于鏈霉親和素,通過生物素和鏈霉親和素之間的特異結(jié)合,Cy3匯集于納米金表面從而實(shí)現(xiàn)FRET。本體系中,隨著OTA濃度的逐漸增大,Cy3的發(fā)射光強(qiáng)度隨之下降。在優(yōu)化條件下,OTA的線性檢測(cè)范圍為2.5 pg m L-1至1μg m L-1,最低檢測(cè)限可達(dá)1.4 pg m L-1。3.核酸適配體傳感器的選擇性和特異性評(píng)價(jià)我們將常見的FB1、DON作為干擾毒素,另將AFB1與OTA互為干擾毒素,分別加入檢測(cè)體系,評(píng)價(jià)上述兩種適配體傳感器對(duì)于非目標(biāo)物的特異性和選擇性。結(jié)果顯示,上述兩種適配體傳感器僅對(duì)目標(biāo)物表現(xiàn)出特異性響應(yīng),表明它們均具有良好的選擇性和特異性。4.選擇小麥提取物及綠咖啡提取物作為模擬樣品,評(píng)價(jià)OTA適配體傳感器在實(shí)際應(yīng)用中的潛力為驗(yàn)證OTA適配體傳感器是否能應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)中,我們分別提取了小麥與綠咖啡的浸取液,并向其中加入已知濃度的OTA標(biāo)準(zhǔn)品,然后用所開發(fā)的適配體傳感器對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:盡管在本模擬體系中所獲得的最低檢出限稍高于實(shí)驗(yàn)室條件下所得到的最低檢出限,但仍然遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國家標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的最大容許濃度,證實(shí)了上述兩種傳感器在實(shí)際檢測(cè)中的應(yīng)用潛力和可行性。綜上所述,本課題中我們充分發(fā)揮納米金和核酸適配體的特性,開發(fā)了兩種應(yīng)用于真菌毒素檢測(cè)的光學(xué)傳感器,在緩沖液中實(shí)現(xiàn)了AFB1和OTA的快速、靈敏、低成本檢測(cè)分析,同時(shí)OTA適配體傳感器在模擬樣品中也收到出色結(jié)果。本課題不僅為真菌毒素檢測(cè)提供了靈敏有效的檢測(cè)方法,同時(shí)也為其他小分子檢測(cè)提供了新思路。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：O657.3;TP212

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