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高穩(wěn)定溶液掃描隧道顯微鏡研制及蛋白質(zhì)亞分子特征成像

發(fā)布時(shí)間:2017-09-13 06:23

  本文關(guān)鍵詞:高穩(wěn)定溶液掃描隧道顯微鏡研制及蛋白質(zhì)亞分子特征成像


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【摘要】:第一臺(tái)掃描隧道顯微鏡于1982年研制成功,使人們實(shí)現(xiàn)了在原子尺度上直接觀察材料表面的精細(xì)結(jié)構(gòu)。隨后又衍生出超高真空掃描隧道顯微鏡,電化學(xué)掃描隧道顯微鏡等適用在不同極端環(huán)境下的家族成員。發(fā)展至今,掃描隧道顯微鏡已經(jīng)廣泛應(yīng)用于材料科學(xué),納米科學(xué)等領(lǐng)域。然而在分子生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi),溶液環(huán)境下的掃描隧道顯微鏡成像依然面臨很大的挑戰(zhàn)。目前已經(jīng)報(bào)道的溶液中的生物大分子STM圖像,尤其是對(duì)于蛋白質(zhì),其分辨率普遍較低;此外,生理?xiàng)l件下的生物分子之間的功能化動(dòng)態(tài)過(guò)程也幾乎沒(méi)有人觀測(cè)到過(guò),上述成像困難主要是由于生物分子在溶液環(huán)境下結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性和掃描隧道顯微鏡性能不夠穩(wěn)定等因素造成的。為了獲得高分辨率的生物單分子STM圖像和捕捉生物分子間的動(dòng)態(tài)功能化過(guò)程,我們搭建了一款適合在溶液環(huán)境下工作的低漏電流、高剛性、高穩(wěn)定掃描隧道顯微鏡,能夠在無(wú)隔音減震的環(huán)境下獲得石墨的原子分辨率圖像,這些優(yōu)勢(shì)在很大程度上提高了掃描隧道顯微鏡在溶液環(huán)境下研究效率。過(guò)渡族金屬硫?qū)倩衔锸且活?lèi)典型的層狀材料,具有著奇特的表面電子態(tài)分布,例如原子缺陷,電荷密度波等。由于這類(lèi)材料的表面性質(zhì)大多比較活潑,容易在大氣中發(fā)生氧化,目前關(guān)于這類(lèi)材料的相關(guān)STM研究基本上都是在低溫超高真空環(huán)境下進(jìn)行的。我們通過(guò)在溶液中對(duì)該類(lèi)層狀樣品進(jìn)行解理,研究了TiSe2,TaS2和MoTe2三個(gè)典型的過(guò)渡族金屬化合物(樣品來(lái)自中科院強(qiáng)磁場(chǎng)中心孫玉平老師課題組),獲得了高清晰的原子分辨率圖像。我們展示了TiSe2材料表面獨(dú)特的單原子缺陷和三角形缺陷結(jié)構(gòu),TaS2在室溫下的近NC相電荷密度波結(jié)構(gòu)以及MoTe2的超分子結(jié)構(gòu)。掃描隧道顯微鏡(STM)能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)分子實(shí)現(xiàn)單分子成像,但大部分圖像是在空氣或者真空條件下獲得,不能夠反映出蛋白質(zhì)分子的真實(shí)結(jié)構(gòu)。利用原子力顯微鏡和電化學(xué)掃描隧道顯微鏡在溶液中對(duì)蛋白質(zhì)分子成像的相關(guān)研究有很多,但是由于蛋白質(zhì)分子的表面結(jié)構(gòu)在溶液環(huán)境下的不穩(wěn)定性以及成像技術(shù)等限制,已報(bào)道的蛋白分子圖像大都呈現(xiàn)球形或者橢球形的大致外形,而無(wú)法展示其亞分子結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié),這極大限制了人們對(duì)蛋白在溶液狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)的了解。NMR技術(shù)雖然能夠?qū)Φ鞍自谌芤籂顟B(tài)下的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析,但是對(duì)蛋白的大小有所要求,并且不能得到單分子成像。因此,實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分子在溶液環(huán)境下的STM高分辨成像,解析蛋白質(zhì)分子的真實(shí)內(nèi)部結(jié)構(gòu)依然面臨非常大的挑戰(zhàn)。我們?yōu)閷?shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)分子的高分辨成像,改進(jìn)了探針針尖包封技術(shù),控制溶液漏電流小于20pA.同時(shí)在傳統(tǒng)恒高成像模式的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)—基于每行隧道電流平均值進(jìn)行一次調(diào)整(取前一行的隧道電流平均值作為下一行掃描的電流值),既能夠在一定程度上保證探針不破壞樣品表面,同時(shí)也保證了成像速度。最后,利用該成像技術(shù),與強(qiáng)磁場(chǎng)中心張欣課題組合作,實(shí)現(xiàn)了鏈霉親和素,抗體和EGFR激酶區(qū)等不同大小和形狀蛋白的單分子高分辨率成像,直接觀測(cè)到三種蛋白質(zhì)分子的細(xì)節(jié)結(jié)構(gòu)。此外,EGFR激酶區(qū)分子的二聚結(jié)構(gòu)以及分子間的動(dòng)態(tài)過(guò)程也首次被直接觀測(cè)到,上述工作已發(fā)表于Nano Research,2016 (IF=8.893, SCI一區(qū)),本人為第一作者。此外,我們通過(guò)給溶液環(huán)境下EGFR激酶區(qū)分子施加一個(gè)0.4T的靜態(tài)穩(wěn)磁場(chǎng),研究了EGFR激酶區(qū)分子對(duì)靜態(tài)磁場(chǎng)的響應(yīng)。在外加磁場(chǎng)作用下,EGFR激酶區(qū)分子動(dòng)能減弱,分子由運(yùn)動(dòng)狀態(tài)變?yōu)殪o止,大連化物所的李國(guó)輝老師課題組通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬驗(yàn)證并解釋了這個(gè)結(jié)果。更重要的是EGFR激酶區(qū)分子的活性也受到了磁場(chǎng)的抑制,磁場(chǎng)強(qiáng)度越強(qiáng),分子活性就越低。通過(guò)STM圖像,我們得到了EGFR激酶區(qū)分子活性受到抑制的原因:磁場(chǎng)改變了EGFR激酶區(qū)分子(端帶有電荷)的取向,阻止EGFR激酶區(qū)分子形成二聚體,而單個(gè)EGFR激酶區(qū)分子只有通過(guò)形成二聚體才具有活性,在我們得到的STM圖像中表現(xiàn)為EGFR激酶區(qū)分子大多沿磁場(chǎng)方向排列,該部分已發(fā)表于Oncotarget,2016 (IF=5.008, SCI一區(qū)),本人為共同第一作者。小分子組裝/解組裝是自然界常見(jiàn)的一種現(xiàn)象,透過(guò)小分子組裝/解組我們可以了解很多維持生命的深層機(jī)制。已報(bào)道的研究中,大多是先將小分子在溶液下完成自組裝,然后吹干,最后在真空環(huán)境下去研究組裝后的結(jié)構(gòu)。在溶液環(huán)境下直接的去觀測(cè)小分子的組裝/解組裝過(guò)程,還未曾報(bào)道過(guò)。我們首先利用掃描隧道顯微鏡在溶液環(huán)境下研究了自組裝完成后的納米纖維內(nèi)部的靜態(tài)分子排列結(jié)構(gòu),隨后又研究了由磷酸激酶控制的小分子組裝過(guò)程和由表皮因子受體激酶區(qū)控制的解組裝過(guò)程,第一次直接觀測(cè)到了上述酶控小分子組裝/解組裝的動(dòng)態(tài)過(guò)程,證實(shí)了關(guān)于組裝/解組裝機(jī)理的正確性。此外納米纖維的自我修復(fù)動(dòng)態(tài)過(guò)程也第一次被直接觀測(cè)到,該部分已發(fā)表于Nanoscale 2016 (IF=7.76, SCI一區(qū)),本人為共同第一作者。
【關(guān)鍵詞】:溶液掃描隧道顯微鏡 溶液環(huán)境 過(guò)渡金屬硫?qū)倩衔?/strong> 蛋白分子 亞分子分辨率 靜態(tài)磁場(chǎng) 組裝/解組裝
【學(xué)位授予單位】:中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:博士
【學(xué)位授予年份】:2016
【分類(lèi)號(hào)】:TH742;Q51
【目錄】:
  • 摘要5-7
  • Abstract7-13
  • 第一章 掃描隧道顯微鏡簡(jiǎn)介13-41
  • §1.1 引言13-14
  • §1.2 掃描隧道顯微鏡14-33
  • 1.2.1 量子隧穿效應(yīng)14-16
  • 1.2.2 成像模式16-17
  • 1.2.3 粗步進(jìn)馬達(dá)17-22
  • 1.2.4 掃描成像裝置22-24
  • 1.2.5 前置信號(hào)放大電路24-27
  • 1.2.6 信號(hào)控制器27-28
  • 1.2.7 隔音減震裝置28
  • 1.2.8 應(yīng)用領(lǐng)域28-33
  • 1.2.9 局限性33
  • §1.3 原子力顯微鏡簡(jiǎn)介33-34
  • 1.3.1 工作原理33-34
  • 1.3.2 成像模式34
  • §1.4 本章小結(jié)34-35
  • 參考文獻(xiàn)35-41
  • 第二章 溶液掃描隧道顯微鏡研制及調(diào)試41-57
  • §2.1 引言41
  • §2.2 搭建溶液掃描隧道顯微鏡的考慮因素41-43
  • 2.2.1 鏡體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性41-42
  • 2.2.2 漏電流42-43
  • §2.3 溶液掃描隧道顯微鏡結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)43-47
  • 2.3.1 雙堆棧馬達(dá)43-44
  • 2.3.2 獨(dú)立掃描頭44-45
  • 2.3.3 鏡體組裝45-46
  • 2.3.4 溶液樣品池46-47
  • §2.4 針尖制備與包封47-49
  • 2.4.1 針尖制備47-48
  • 2.4.2 針尖絕緣包封48-49
  • §2.5 調(diào)試結(jié)果49-54
  • 2.5.1 隧道電流譜49-51
  • 2.5.2 石墨原子分辨率成像51
  • 2.5.3 漂移速度測(cè)定51-53
  • 2.5.4 石墨烯原子分辨率成像53-54
  • §2.6 本章小結(jié)54-55
  • 參考文獻(xiàn)55-57
  • 第三章 過(guò)渡族金屬硫?qū)倩衔镌臃直媛食上?/span>57-69
  • §3.1 研究背景57-58
  • §3.2 試驗(yàn)方法58-59
  • 3.2.1 單晶樣品生長(zhǎng)58-59
  • 3.2.2 溶液中單晶樣品解理59
  • §3.3 TiSe_2表面缺陷STM成像59-61
  • §3.4 MoTe_2超結(jié)構(gòu)STM成像61-62
  • §3.5 TaS_2電荷密度波STM成像62-64
  • §3.6 本章小結(jié)64-65
  • 參考文獻(xiàn)65-69
  • 第四章 蛋白質(zhì)亞分子特征STM成像69-89
  • §4.1 研究背景69-71
  • §4.2 適用于生物分子成像的Line-based恒高模式71
  • §4.3 鏈霉親和素和抗體亞分子特征STM成像71-73
  • 4.3.1 鏈霉親和素成像結(jié)果71-72
  • 4.3.2 抗體成像結(jié)果72-73
  • §4.4 表皮生長(zhǎng)因子受體激酶區(qū)亞分子特征STM成像73-79
  • 4.4.1 EGFR激酶區(qū)單分子成像73-74
  • 4.4.2 EGFR激酶區(qū)分子取向成像74-75
  • 4.4.3 EGFR激酶區(qū)二聚體結(jié)構(gòu)成像75-76
  • 4.4.4 EGFR激酶區(qū)分子間相互作用成像76
  • 4.4.5 蛋白分子尺寸增大效應(yīng)的解釋76-77
  • 4.4.6 EGFR激酶區(qū)分子的磁場(chǎng)效應(yīng)77-79
  • §4.5 質(zhì)粒和雙螺旋DNA高分辨STM成像79-81
  • 4.5.1 質(zhì)粒高分辨成像79-80
  • 4.5.2 雙螺旋DNA高分辨成像80-81
  • §4.6 氨基酸小分子高分辨STM成像81-82
  • §4.7 本章小結(jié)82-83
  • 參考文獻(xiàn)83-89
  • 第五章 酶控小分子組裝與解組裝動(dòng)態(tài)過(guò)程STM成像89-107
  • §5.1 分子自組裝簡(jiǎn)介89-90
  • 5.1.1 自組裝原理89
  • 5.1.2 自組裝的常用表征技術(shù)89-90
  • 5.1.3 自組裝的應(yīng)用90
  • §5.2 酶控小分子組裝與解組裝STM成像90-100
  • 5.2.1 研究背景90-91
  • 5.2.2 酶控小分子組裝與解組裝機(jī)理91
  • 5.2.3 納米纖維高分辨STM成像91-95
  • 5.2.4 ALP控制的自組裝動(dòng)態(tài)過(guò)程STM成像95-96
  • 5.2.5 EGFR激酶區(qū)控制的解組裝動(dòng)態(tài)過(guò)程STM成像96-99
  • 5.2.6 納米纖維自我修復(fù)動(dòng)態(tài)過(guò)程STM成像99-100
  • 5.2.7 實(shí)驗(yàn)存在的缺陷100
  • §5.3 本章小結(jié)100-101
  • 參考文獻(xiàn)101-107
  • 第六章 總結(jié)與展望107-109
  • 致謝109-111
  • 在讀期間發(fā)表的論文及取得的研究成果111

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