本文關(guān)鍵詞：基于熒光時(shí)空調(diào)控的超分辨顯微方法與系統(tǒng)研究

  更多相關(guān)文章： 超分辨 熒光顯微術(shù) 點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)工程 STED 熒光漂白

【摘要】：遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)顯微成像技術(shù)具有無(wú)損、特異性強(qiáng)、穿透深度深等優(yōu)點(diǎn),是生物醫(yī)學(xué)研究中的重要工具。然而,由于光學(xué)衍射極限的存在,遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)顯微成像技術(shù)的分辨率被限制在200nnm左右,無(wú)法滿足現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究的需求。共聚焦顯微技術(shù)可以有效提高遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)顯微成像技術(shù)的分辨率,然而其分辨率依然受到光學(xué)衍射極限的限制。熒光顯微成像技術(shù)具有高信噪比、特異性強(qiáng)、多參量等優(yōu)點(diǎn),特別適用于長(zhǎng)時(shí)程生物樣品的觀測(cè)。熒光顯微的“選擇性標(biāo)記,選擇性激發(fā)”的成像特點(diǎn),理論上可以突破衍射極限的限制。因此,基于熒光理論的超分辨顯微術(shù)是遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)超分辨顯微技術(shù)中的代表性技術(shù)。然而,現(xiàn)有的超分辨技術(shù)仍存在很多問(wèn)題,例如分辨率不夠高、系統(tǒng)復(fù)雜、樣品適用范圍窄、成像速度慢等。本論文基于熒光能級(jí)理論與共聚焦技術(shù),通過(guò)對(duì)熒光進(jìn)行時(shí)空調(diào)控,旨在獲取分辨率更高、系統(tǒng)更加簡(jiǎn)化、對(duì)熒光樣品適用范圍更廣、更多元的光學(xué)超分辨顯微方法和系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)熒光樣品的亞百納米分辨率成像。主要工作和創(chuàng)新點(diǎn)如下：(1) 提出了兩種基于探測(cè)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)調(diào)制的超分辨方法和系統(tǒng)：通過(guò)對(duì)普通共聚焦系統(tǒng)進(jìn)行簡(jiǎn)單的改造,以及對(duì)熒光的“虛擬空間調(diào)控”,基于探測(cè)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)調(diào)制的超分辨方法和系統(tǒng)具有分辨率高、實(shí)時(shí)成像、信噪比高、系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、樣品適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。(2) 基于時(shí)間門控技術(shù)和基于受激輻射的熒光時(shí)空調(diào)控技術(shù),提出了一種離線式時(shí)間門控STED超分辨系統(tǒng)；同時(shí)利用熒光壽命分布,創(chuàng)新性地提出了一種基于熒光壽命分布的光斑對(duì)準(zhǔn)方法：本系統(tǒng)獲得38nm-50nm的高分辨率,同時(shí)相對(duì)于普通STED,系統(tǒng)得到了大大的簡(jiǎn)化,所需受激輻射光強(qiáng)也大大減弱。(3) 設(shè)計(jì)并搭建了一套基于STED和FED雙模式快速掃描超分辨顯微系統(tǒng)：創(chuàng)造性地將STED和FED兩類超分辨技術(shù)集成在同一套系統(tǒng)中,本系統(tǒng)具有樣品適用范圍廣、成像速度快、分辨率高等特點(diǎn),系統(tǒng)STED模式可以獲得110nm左右分辨率,FED模式可以獲取140nnm左右分辨率。(4) 研究了STED系統(tǒng)中抗漂白封片荊、顆粒樣品、生物樣品的相關(guān)制備方法,對(duì)于緩解STED方法中樣品的漂白問(wèn)題有重要意義。(5) 提出了一種共聚焦系統(tǒng)下基于熒光漂白與熒光隨機(jī)定位超分辨方法：針對(duì)熒光顯徽成像中的漂白問(wèn)題,“變廢為寶”。本方法采用普通的共聚焦結(jié)構(gòu),有非常高的應(yīng)用意義。基于熒光漂白與熒光隨機(jī)定位超分辨方法具有高分辨率、樣品適用范圍廣、系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：超分辨 熒光顯微術(shù) 點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)工程 STED 熒光漂白
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：TP391.41;TH742
【目錄】：

• 致謝5-7
• 摘要7-9
• Abstract9-22
• 1 緒論22-42
• 1.1 光學(xué)顯微成像的早期探索22-24
• 1.2 熒光顯微成像技術(shù)24-27
• 1.2.1 熒光能級(jí)圖25-26
• 1.2.2 幾個(gè)重要的熒光概念26-27
• 1.2.3 常見(jiàn)非熒光過(guò)程27
• 1.3 共聚焦顯微成像技術(shù)27-29
• 1.4 遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)超分辨顯微成像29-36
• 1.4.1 研究意義29-30
• 1.4.2 基于點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)工程的遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)超分辨顯微成像方法30-31
• 1.4.3 基于熒光隨機(jī)定位方法的遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)超分辨顯微成像方法31-33
• 1.4.4 基于頻域擴(kuò)展的遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)超分辨成像方法33-34
• 1.4.5 其他遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)超分辨成像方法34-36
• 1.5 現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足36-37
• 1.6 本論文的研究?jī)?nèi)容及創(chuàng)新點(diǎn)37-41
• 1.6.1 本論文的研究?jī)?nèi)容37-38
• 1.6.2 本論文的結(jié)構(gòu)38-40
• 1.6.3 本論文的創(chuàng)新點(diǎn)40-41
• 1.7 本章小結(jié)41-42
• 2 基于探測(cè)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)空間調(diào)控的超分辨方法和系統(tǒng)的研究42-70
• 2.1 引言42-43
• 2.2 理論基礎(chǔ)43-50
• 2.2.1 標(biāo)量衍射理論43-44
• 2.2.2 標(biāo)量衍射理論的聚焦模型44-46
• 2.2.3 光學(xué)顯微成像分辨率46-48
• 2.2.4 提高顯微系統(tǒng)分辨率的傳統(tǒng)方法48-49
• 2.2.5 其他限制分辨率的因素49-50
• 2.3 基于探測(cè)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)橫向位移差分的成像方法和系統(tǒng)研究50-61
• 2.3.1 技術(shù)背景50-52
• 2.3.2 系統(tǒng)設(shè)計(jì)52-53
• 2.3.3 理論分析53-54
• 2.3.4 參數(shù)優(yōu)化54-57
• 2.3.5 LDCM實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證57-58
• 2.3.6 偏振與信噪比對(duì)成像效果的影響分析58-60
• 2.3.7 小結(jié)60-61
• 2.4 基于探測(cè)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)孔徑函數(shù)調(diào)制的超分辨方法和系統(tǒng)的研究61-68
• 2.4.1 技術(shù)背景61
• 2.4.2 系統(tǒng)設(shè)計(jì)61-62
• 2.4.3 理論分析62-65
• 2.4.4 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證65-68
• 2.4.5 小結(jié)68
• 2.5 基于探測(cè)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)空間調(diào)控的超分辨方法的特點(diǎn)總結(jié)68-69
• 2.6 本章小結(jié)69-70
• 3 基于受激輻射的時(shí)空調(diào)制超分辨顯微系統(tǒng)及成像研究70-106
• 3.1 引言70-71
• 3.2 系統(tǒng)總體介紹71-73
• 3.3 照明模塊設(shè)計(jì)73-82
• 3.3.1 波長(zhǎng)的選擇73
• 3.3.2 激發(fā)光的重頻選擇73-74
• 3.3.3 聚焦光斑理論優(yōu)化74-78
• 3.3.4 激發(fā)光路描述78-79
• 3.3.5 受激輻射光光路描述79-80
• 3.3.6 照明光路偏振調(diào)制80-81
• 3.3.7 擴(kuò)束系統(tǒng)存在的意義81
• 3.3.8 反射面型對(duì)照明光聚焦光斑的影響81-82
• 3.4 掃描模塊設(shè)計(jì)82-83
• 3.5 探測(cè)模塊設(shè)計(jì)83-84
• 3.5.1 探測(cè)模塊組成83
• 3.5.2 探測(cè)光路描述83-84
• 3.5.3 多模光纖芯徑大小84
• 3.6 系統(tǒng)光斑對(duì)準(zhǔn)84-87
• 3.6.1 光斑對(duì)準(zhǔn)的意義84-85
• 3.6.2 光束粗對(duì)準(zhǔn)過(guò)程85-86
• 3.6.3 精細(xì)校準(zhǔn)86-87
• 3.7 基于熒光壽命分布的光斑新對(duì)準(zhǔn)方法87-93
• 3.7.1 研究背景87-88
• 3.7.2 理論基礎(chǔ)88-90
• 3.7.3 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證90-93
• 3.8 時(shí)間門控連續(xù)光受激輻射損耗超分辨93-97
• 3.8.1 理論描述93-95
• 3.8.2 離線式時(shí)間門控技術(shù)的重要性95-96
• 3.8.3 離線式時(shí)間門控的操作96-97
• 3.9 成像結(jié)果97-100
• 3.9.1 暗斑成像效果97
• 3.9.2 納米顆粒成像結(jié)果97-98
• 3.9.3 生物樣品成像結(jié)果98-100
• 3.10 系統(tǒng)信噪比問(wèn)題100-104
• 3.10.1 信噪比與分辨率100
• 3.10.2 反卷積算法提升信噪比100-103
• 3.10.3 雙門控提升信噪比方法103-104
• 3.11 本章小結(jié)104-106
• 4 基于STED和FED雙模式快速掃描的空間調(diào)制超分辨系統(tǒng)及成像研究106-126
• 4.1 引言106
• 4.2 FED技術(shù)簡(jiǎn)介106-109
• 4.2.1 FED技術(shù)發(fā)展106-107
• 4.2.2 FED基本原理107-109
• 4.3 系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與調(diào)試109-117
• 4.3.1 系統(tǒng)總體介紹109-110
• 4.3.2 FED成像光路描述110-111
• 4.3.3 STED成像光路描述111-112
• 4.3.4 振鏡掃描模塊112-114
• 4.3.5 系統(tǒng)重要參數(shù)計(jì)算114
• 4.3.6 系統(tǒng)控制與信號(hào)傳遞114-117
• 4.4 系統(tǒng)光斑校準(zhǔn)117-120
• 4.4.1 粗對(duì)準(zhǔn)117-118
• 4.4.2 FED雙光束重合118
• 4.4.3 STED雙光束重合118-120
• 4.5 成像結(jié)果分析120-124
• 4.5.1 STED模式成像120-121
• 4.5.2 FED模式成像121-123
• 4.5.3 易漂白樣品雙模式測(cè)試123-124
• 4.6 本章小結(jié)124-126
• 5 STED超分辨系統(tǒng)中的樣品制備126-132
• 5.1 引言126
• 5.2 高功率下STED成像可能存在的問(wèn)題126-128
• 5.2.1 熒光樣品漂白126-127
• 5.2.2 熒光樣品燃燒127-128
• 5.3 樣品制作方式選擇128
• 5.4 封片劑的選擇與制備128-129
• 5.4.1 Mowiol制作過(guò)程128-129
• 5.4.2 TDE制作過(guò)程129
• 5.5 顆粒樣品的制備過(guò)程129-130
• 5.6 生物細(xì)胞的制備過(guò)程130-131
• 5.7 本章小結(jié)131-132
• 6 基于熒光漂白與熒光隨機(jī)定位的時(shí)間調(diào)制超分辨方法和系統(tǒng)的研究132-144
• 6.1 引言132
• 6.2 技術(shù)背景132-133
• 6.3 系統(tǒng)要求133-135
• 6.3.1 系統(tǒng)光路描述133-134
• 6.3.2 系統(tǒng)控制和電信號(hào)處理134-135
• 6.3.3 系統(tǒng)成像重要參數(shù)設(shè)定135
• 6.4 理論分析與仿真135-139
• 6.4.1 方法流程135-137
• 6.4.2 恢復(fù)算法選擇137
• 6.4.3 方法仿真137-139
• 6.5 成像結(jié)果分析139-142
• 6.5.1 熒光顆粒樣品139-140
• 6.5.2 生物細(xì)胞140-142
• 6.6 本章小結(jié)142-144
• 7 總結(jié)與展望144-146
• 參考文獻(xiàn)146-158
• 作者簡(jiǎn)介158-160
• 攻讀博士學(xué)位期間主要的研究成果160-162

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