本文關鍵詞：SIM顯微鏡照明結構光場優(yōu)化與系統(tǒng)點擴散函數表征

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【摘要】：熒光顯微鏡具有可特異性標記、對活體細胞實時動態(tài)成像等優(yōu)勢,在細胞生物學研究中獲得廣泛的應用。然而,由于衍射極限的存在,傳統(tǒng)熒光顯微鏡的分辨率受到限制。這嚴重阻礙了傳統(tǒng)熒光顯微鏡在亞細胞水平研究中的進一步應用。為了突破衍射極限的限制,近年來,研究人員提出了一系列超分辨熒光顯微技術。盡管如此,長時間活細胞成像對這些方法仍然存在著較大的挑戰(zhàn)。結構光照明超分辨熒光顯微成像技術(Structured Illumination Microscopy,SIM)是根據莫爾效應提出的一種技術。其原理為:利用空間有結構的光束來激發(fā)熒光,激發(fā)圖形和熒光團密度的混合頻率,將樣品中通常不可見的高頻信息攜帶到顯微鏡的可見低通頻帶;通過改變圖案的方向和相位,記錄熒光結果并對得到的多個圖像數據集進行適當的處理,提取攜帶的高頻信息并重建出超分辨率圖像。SIM橫向分辨率理論上可以達到傳統(tǒng)熒光顯微鏡的兩倍,且其成像速度快,對熒光標記沒有特殊要求。這些特點使得SIM在細胞生理學、細胞動力學等亞細胞水平的生命科學研究中有更廣闊的應用前景。本文基于LED光源和可編程數字微鏡陣列(Digital Micro-mirror Device,DMD),設計和搭建了結構光照明超分辨熒光顯微鏡。利用設計的結構光生成模塊與奧林巴斯X73顯微鏡結合做成了SIM超分辨成像系統(tǒng),并設計了SIM超分辨重構算法。對使用LED、DMD和物鏡結合產生余弦結構光進行了理論分析以及仿真實驗。通過理論分析、仿真以及實驗,提出了使用熒光微球精確測量系統(tǒng)分辨率的新算法。使用自搭建顯微鏡(40倍、數值孔徑0.75的物鏡)對細胞肌動蛋白絲(激發(fā)/發(fā)射波長:650nm/668nm)成像,測量得到SIM系統(tǒng)分辨率為307nm,傳統(tǒng)寬場熒光顯微鏡系統(tǒng)分辨率為545nm,較傳統(tǒng)熒光顯微鏡SIM系統(tǒng)分辨率提高了1.78倍;使用自搭建結構光生成模塊和奧林巴斯顯微鏡(100倍、數值孔徑1.4的物鏡),對直徑200nm的熒光微球(激發(fā)/發(fā)射波長:660nm/680nm)成像,測量寬場成像和SIM成像中熒光微球半高寬(Full Width at Half Maximum,FWHM)分別為328nm、203nm,利用本文設計的系統(tǒng)分辨率測量算法,得到寬場顯微鏡系統(tǒng)和SIM超分辨成像系統(tǒng)的分辨率分別為312nm、170nm,較傳統(tǒng)寬場熒光顯微鏡,SIM系統(tǒng)的分辨率提高了1.84倍。實驗表明,本文搭建的基于LED和DMD的結構光照明超分辨熒光顯微鏡系統(tǒng)突破了衍射極限的限制,實現了超分辨熒光成像。
【關鍵詞】：熒光顯微鏡 超分辨率 結構光 衍射極限 數字微鏡陣列
【學位授予單位】：中國科學院研究生院(長春光學精密機械與物理研究所)
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：TH742
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第1章 緒論11-23
• 1.1 研究背景及意義11
• 1.2 熒光顯微鏡系統(tǒng)的分辨率11-14
• 1.2.1 阿貝定律12
• 1.2.2 瑞利判據12-13
• 1.2.3 半高寬(Full Width at Half Maximum, FWHM)13-14
• 1.3 提高顯微鏡分辨率的一般方法14-17
• 1.3.1 去卷積顯微鏡14-15
• 1.3.2 共聚焦顯微鏡15-16
• 1.3.3 雙光子熒光顯微鏡16-17
• 1.4 超分辨率顯微技術17-22
• 1.4.1 基于單分子定位的超分辨成像技術18-19
• 1.4.2 基于模式照明的超分辨成像技術19-22
• 1.5 本論文的主要工作22-23
• 第2章 SIM基本原理23-31
• 2.1 寬場熒光顯微鏡成像原理23-25
• 2.2 結構光照明熒光顯微鏡成像原理25-27
• 2.3 結構光照明熒光顯微鏡算法27-30
• 2.3.1 頻譜分離27-28
• 2.3.2 頻譜配準28
• 2.3.3 頻譜融合28-30
• 2.4 本章小結30-31
• 第3章 結構光場優(yōu)化31-47
• 3.1 結構光生成模塊設計及整體光路介紹31-35
• 3.1.1 傳統(tǒng)結構光照明光生成方案31
• 3.1.2 本文結構光照明光生成方案及整體光路介紹31-33
• 3.1.3 LED光源介紹33
• 3.1.4 數字微鏡陣列(DMD)介紹33-35
• 3.2 基于LED和DMD的余弦光生成原理及仿真35-44
• 3.2.1 基于LED和DMD的余弦光生成原理35-38
• 3.2.2 DMD產生的矩形波測試38-41
• 3.2.3 基于LED和DMD的余弦光生成理論仿真41-44
• 3.3 結構光生成模塊設計44-45
• 3.4 本章小結45-47
• 第4章 系統(tǒng)點擴散函數測量47-57
• 4.1 系統(tǒng)點擴散函數測量方法簡介47-48
• 4.2 系統(tǒng)點擴散函數測量原理48-49
• 4.3 BSF與PSF半峰全寬的關系模型49-52
• 4.4 寬場熒光顯微鏡點擴散函數測量52-53
• 4.5 使用熒光微球測量系統(tǒng)點擴散函數的算法53-56
• 4.5.1 提取熒光微球矩陣大小53-54
• 4.5.2 熒光微球定位算法54-56
• 4.6 本章小結56-57
• 第5章 超分辨成像實驗57-73
• 5.1 成像系統(tǒng)標定57-61
• 5.1.1 SCMOS前的管透鏡介紹57-59
• 5.1.2 系統(tǒng)定標59-61
• 5.2 細胞肌動蛋白微絲的超分辨成像61-68
• 5.2.1 實驗條件61-62
• 5.2.2 細胞肌動蛋白微絲(Actin Filaments)制作62-63
• 5.2.3 實驗結果與分析63-66
• 5.2.4 系統(tǒng)性能分析66-68
• 5.3 熒光微球的超分辨成像68-72
• 5.3.1 實驗條件68-69
• 5.3.2 實驗結果與分析69-72
• 5.4 本章小結72-73
• 第6章 總結與展望73-75
• 6.1 本文主要內容和研究結論73-74
• 6.2 創(chuàng)新點74
• 6.3 展望74-75
• 參考文獻75-81
• 在學期間學術成果情況81-82
• 指導教師及作者簡介82-83
• 致謝83

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1 薛博;陳小梅;毛冰晶;倪國強;;鏡面微振動時點擴散函數的仿真分析[J];電子科技大學學報;2014年01期

2 田原Z，

本文編號：532907