搭建了一種聯(lián)用超分辨熒光和三維形貌顯微成像系統(tǒng)（Correlative super-resolution fluorescence and three-dimensional topography imaging microscopy）,以聚合纖維狀肌動(dòng)蛋白（F-actin）為例,評(píng)價(jià)了此聯(lián)用系統(tǒng)的性能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,此聯(lián)用儀器具有納米級(jí)分辨率的三維形貌及具體成分的定位分布成像功能,可實(shí)現(xiàn)在形貌圖中定位具體成分的功能,表明此聯(lián)用儀器可應(yīng)用于研究分析細(xì)胞骨架及細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)（如細(xì)胞膜蛋白質(zhì)聚集體的組成和分布特性等）方面,此聯(lián)用系統(tǒng)在生命科學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。 

【文章來(lái)源】：分析化學(xué). 2020,48(02)北大核心EISCICSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：6 頁(yè)

【部分圖文】：

三維超分辨熒光和形貌顯微鏡聯(lián)用系統(tǒng)示意圖

為了考察三維超分辨熒光和形貌顯微鏡聯(lián)用儀器的性能,采用G-actin在體外聚合形成的F-actin為測(cè)試樣品,進(jìn)行聯(lián)用成像。如圖2A所示,左側(cè)圖像為AFM形貌圖,顯示了一些纖維狀凸起物及一些球形顆粒。根據(jù)文獻(xiàn)[21]中報(bào)道的肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu),推測(cè)這些纖維狀凸起物和球形顆粒分別為聚合F-actin和游離G-actin。此外,從AFM圖像(如圖2A左圖)中觀察到具有不同高度及寬度的纖維狀凸起物,推測(cè)這是由于F-actin的聚合程度不同引起的。為測(cè)定AFM-dSTORM聯(lián)用系統(tǒng)中的AFM成像模式能否提供高分辨圖像,本研究選擇寬度細(xì)小的低聚F-actin(如圖2A左圖中的白色箭頭)及粒徑小的游離G-actin(如圖2A左圖中的藍(lán)色箭頭)進(jìn)行高度及半峰全寬的測(cè)定,并與文獻(xiàn)[21]中報(bào)道的肌動(dòng)蛋白尺寸進(jìn)行比較, 以確定AFM成像的分辨率。通過(guò)對(duì)箭頭處低聚F-actin和游離G-actin進(jìn)行高度分布分析及高斯分布擬合,獲得的低聚F-actin的高度及半峰全寬為10和30 nm(圖2B上圖),游離G-actin的高度及半峰全寬為7 和16 nm(圖2B下圖)。對(duì)比文獻(xiàn)[21]中報(bào)道的單個(gè)G-actin直徑(5.5 nm)及單聚F-actin直徑(8 nm),發(fā)現(xiàn)箭頭處的G-actin和F-actin的半峰全寬雖然由于AFM探針針尖的加寬效應(yīng)而大于文獻(xiàn)中報(bào)道的肌動(dòng)蛋白尺寸,但測(cè)定的高度與文獻(xiàn)[12]中肌動(dòng)蛋白尺寸相符,因此,本聯(lián)用系統(tǒng)中的AFM成像可實(shí)現(xiàn)對(duì)肌動(dòng)蛋白的高分辨成像。圖2C左側(cè)圖像為dSTORM圖像,顯示了特異性標(biāo)記蛋白F-actin的分布,右側(cè)圖像為放大圖,更清晰地揭示了F-actin的分布及聚合程度。為測(cè)定聯(lián)用系統(tǒng)中的dSTORM成像分辨率,選擇寬度細(xì)小的低聚F-actin區(qū)域(如圖2C右圖中的白色線條),并對(duì)其熒光強(qiáng)度分布進(jìn)行高斯擬合,以測(cè)定F-actin的半峰全寬。如圖2D所示,dSTORM圖中所測(cè)得的低聚F-actin的半峰全寬為20～30 nm,比單聚F-actin的直徑(8 nm)大,表明聯(lián)用系統(tǒng)中的dSTORM成像可達(dá)到約20 nm的分辨率,與文獻(xiàn)[14, 22]中報(bào)道的dSTORM分辨率(20 nm)相當(dāng)。上述結(jié)果表明,搭建的聯(lián)用儀器可實(shí)現(xiàn)dSTORM的超分辨熒光成像。為了將具體蛋白F-actin的分布精確定位到對(duì)應(yīng)的三維形貌圖中,需將形貌圖中肌動(dòng)蛋白的結(jié)構(gòu)與基底區(qū)分。如圖2A所示,通過(guò)設(shè)置閾值(基底的高度),可區(qū)分基底和肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)。為方便后續(xù)圖像匹配優(yōu)化,將小于等于閾值的高度值定義為0,即h=0代表基底; 將大于閾值的高度值減去閾值,即h值代表肌動(dòng)蛋白的高度,且h>0代表肌動(dòng)蛋白的結(jié)構(gòu)。將提取的肌動(dòng)蛋白三維結(jié)構(gòu)與具體蛋白F-actin的分布導(dǎo)入MATLAB配準(zhǔn)程序中,并根據(jù)AFM和dSTORM圖中F-actin的結(jié)構(gòu),優(yōu)化仿射變換參數(shù)以實(shí)現(xiàn)精確定位。如圖3A所示,左側(cè)圖像為AFM形貌圖,通過(guò)閾值扣除法將F-actin結(jié)構(gòu)(紅色區(qū)域)與基底(黑色區(qū)域)分割出來(lái); 中間圖像為經(jīng)仿射變換后的dSTORM圖像,展示了特異性標(biāo)記蛋白F-actin的空間分布; 右側(cè)圖像為AFM形貌圖和經(jīng)仿射變換后的dSTORM圖像間的疊加圖,顯示出具體蛋白F-actin在形貌圖中的定位分布情況, 表明利用dSTORM成像得到的特異性標(biāo)記蛋白F-actin的分布與AFM形貌圖中的纖維狀結(jié)構(gòu)重疊,證明AFM-dSTORM聯(lián)用顯微鏡能夠?qū)⑻囟ǖ鞍追肿泳_定位到AFM形貌圖中。為進(jìn)一步定量分析AFM和dSTORM圖間的匹配效果, 通過(guò)比較dSTORM定位點(diǎn)出現(xiàn)在基底處(h=0)以及F-actin處(h>0)的幾率來(lái)確定以及優(yōu)化這兩種圖像間的重疊程度,即比較h=0及h > 0處的dSTORM定位點(diǎn)密度。如圖3B所示,h > 0處的dSTORM定位點(diǎn)密度為2353 μm-2,而h=0處的dSTORM定位點(diǎn)密度只有318 μm-2,表明dSTORM定位點(diǎn)出現(xiàn)在F-actin處的幾率大于出現(xiàn)在基底處,即證明AFM和dSTORM圖像間的重疊程度很好。綜上,此聯(lián)用儀器可實(shí)現(xiàn)在單分子水平上對(duì)具體成分的空間分布和整體形貌間的關(guān)聯(lián)分析。

為了將具體蛋白F-actin的分布精確定位到對(duì)應(yīng)的三維形貌圖中,需將形貌圖中肌動(dòng)蛋白的結(jié)構(gòu)與基底區(qū)分。如圖2A所示,通過(guò)設(shè)置閾值(基底的高度),可區(qū)分基底和肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)。為方便后續(xù)圖像匹配優(yōu)化,將小于等于閾值的高度值定義為0,即h=0代表基底; 將大于閾值的高度值減去閾值,即h值代表肌動(dòng)蛋白的高度,且h>0代表肌動(dòng)蛋白的結(jié)構(gòu)。將提取的肌動(dòng)蛋白三維結(jié)構(gòu)與具體蛋白F-actin的分布導(dǎo)入MATLAB配準(zhǔn)程序中,并根據(jù)AFM和dSTORM圖中F-actin的結(jié)構(gòu),優(yōu)化仿射變換參數(shù)以實(shí)現(xiàn)精確定位。如圖3A所示,左側(cè)圖像為AFM形貌圖,通過(guò)閾值扣除法將F-actin結(jié)構(gòu)(紅色區(qū)域)與基底(黑色區(qū)域)分割出來(lái); 中間圖像為經(jīng)仿射變換后的dSTORM圖像,展示了特異性標(biāo)記蛋白F-actin的空間分布; 右側(cè)圖像為AFM形貌圖和經(jīng)仿射變換后的dSTORM圖像間的疊加圖,顯示出具體蛋白F-actin在形貌圖中的定位分布情況, 表明利用dSTORM成像得到的特異性標(biāo)記蛋白F-actin的分布與AFM形貌圖中的纖維狀結(jié)構(gòu)重疊,證明AFM-dSTORM聯(lián)用顯微鏡能夠?qū)⑻囟ǖ鞍追肿泳_定位到AFM形貌圖中。為進(jìn)一步定量分析AFM和dSTORM圖間的匹配效果, 通過(guò)比較dSTORM定位點(diǎn)出現(xiàn)在基底處(h=0)以及F-actin處(h>0)的幾率來(lái)確定以及優(yōu)化這兩種圖像間的重疊程度,即比較h=0及h > 0處的dSTORM定位點(diǎn)密度。如圖3B所示,h > 0處的dSTORM定位點(diǎn)密度為2353 μm-2,而h=0處的dSTORM定位點(diǎn)密度只有318 μm-2,表明dSTORM定位點(diǎn)出現(xiàn)在F-actin處的幾率大于出現(xiàn)在基底處,即證明AFM和dSTORM圖像間的重疊程度很好。綜上,此聯(lián)用儀器可實(shí)現(xiàn)在單分子水平上對(duì)具體成分的空間分布和整體形貌間的關(guān)聯(lián)分析。4 結(jié) 論


本文編號(hào)：3513219