在熒光顯微鏡的發(fā)展歷程中,研究的重點(diǎn)關(guān)注方向一直在發(fā)生變化。從開(kāi)始時(shí)的對(duì)系統(tǒng)分辨率的關(guān)注到如何對(duì)樣品更深位置的成像,而近年來(lái)重點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)向了熒光顯微鏡如何更好地應(yīng)用于實(shí)際的生物成像中。光片照明顯微鏡以其對(duì)樣品的低損傷以及快速成像的特性,逐漸被生物學(xué)家所接受并成為主流的觀察長(zhǎng)時(shí)間生物過(guò)程的手段。然而由于光束的衍射特性,光片照明顯微鏡存在大視場(chǎng)和高軸向分辨率的取舍問(wèn)題。基于以上背景,本論文在光片照明顯微鏡方面進(jìn)行研究,主要工作如下:（1）設(shè)計(jì)并搭建一套大視場(chǎng)光片照明顯微系統(tǒng)。通過(guò)聯(lián)合貝塞爾光束照明和滾動(dòng)曝光的方式,在保證高軸向分辨率的同時(shí),擴(kuò)大系統(tǒng)的視場(chǎng)。此外,編寫(xiě)了系統(tǒng)控制軟件,并對(duì)斑馬魚(yú)等樣品進(jìn)行成像實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)表明該系統(tǒng)軸向分辨率達(dá)到3μm,單幅視場(chǎng)達(dá)到800μm以上,達(dá)到設(shè)計(jì)指標(biāo)。（2）搭建一套小視場(chǎng)三維高分辨的晶格光片照明顯微鏡。通過(guò)雙層光路,監(jiān)測(cè)相機(jī)系統(tǒng)和套筒結(jié)構(gòu)的創(chuàng)新設(shè)計(jì),降低了系統(tǒng)的調(diào)節(jié)難度,提高系統(tǒng)的穩(wěn)定性。完成顯微鏡系統(tǒng)控制軟件,實(shí)現(xiàn)了系統(tǒng)設(shè)計(jì)目標(biāo),系統(tǒng)穩(wěn)定性得到提高。（3）對(duì)光片照明顯微鏡的軸向分辨率提升進(jìn)行相關(guān)研究。對(duì)于普通光片照明顯微鏡,提出模式調(diào)制光片照明顯微鏡的方... 

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圖１－１光片照明顯微鏡簡(jiǎn)化原理圖藍(lán)色箭頭代表激發(fā)光，綠色箭頭代表反射光或熒光）??光片的產(chǎn)生方式通常有兩種，一種方式是通過(guò)柱面鏡對(duì)準(zhǔn)直后的光束進(jìn)行聚焦，即可??

應(yīng)??用都是為了在具體的成像要求中，產(chǎn)生最有利于觀測(cè)的光片照明顯微鏡的參數(shù)，包括分辨??率，視場(chǎng)，層析能力等。下面，本文將對(duì)幾種常見(jiàn)且較有影響力的光束調(diào)制技術(shù)在光片照??明顯微鏡中的應(yīng)用進(jìn)行分析及說(shuō)明。??１．２．１．１貝塞爾光束??貝塞爾光束是在光片照明顯微鏡中最廣泛應(yīng)用的利用光束整形技術(shù)的例子｜１７￣１８］。相比??于同樣最大通光直徑的高斯光束，貝塞爾光束在保持軸向分辨率的同時(shí)極大地增加了成像??視常貝塞爾光束是抗衍射光束的一種，其橫截面由滿(mǎn)足貝塞爾分布的多圈圓環(huán)組成，如??圖１－２所示。理想的貝塞爾光束傳播時(shí)不受衍射影響，即與高斯光束不同，理想的貝塞爾??光束主瓣不會(huì)隨著傳播而改變形狀。此外，貝塞爾光束還具有自愈合特性。在貝塞爾光束??傳播時(shí)，對(duì)于傳播光路上可能存在的較小的障礙物，貝塞爾光束可以繼續(xù)進(jìn)行傳播，而不??受到障礙物的影響１１９］。然而，理想的貝塞爾光束在物鏡后焦面上的截?cái)嘈螤顬橐粋�(gè)寬度無(wú)??限小的環(huán)，在實(shí)際使用中會(huì)導(dǎo)致光的利用率極低。所以一般在應(yīng)用時(shí)會(huì)將環(huán)的寬度略微增??加，這會(huì)使得貝塞爾光束在長(zhǎng)距離的傳播中會(huì)有所展寬，但是依然具有極明顯的增加視場(chǎng)??的作用。??Ｉ??！??圖１－２貝塞爾光束橫截面及沿徑向強(qiáng)度分布［２〇】??１．２．１．２光學(xué)晶格??光學(xué)晶格，如圖１－３所示，同樣是抗衍射光束的一種。不同于貝塞爾光束在物鏡后焦??面的圓環(huán)內(nèi)強(qiáng)度分布均句，光學(xué)晶格在物鏡后焦面的強(qiáng)度分布同樣被限制在圓環(huán)內(nèi)，但是??圓環(huán)內(nèi)具有一定強(qiáng)度分布，具體的分布可以通過(guò)精密的計(jì)算得到。相比于高斯光片，光學(xué)??晶格更適合于高分辨率的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)成像。光學(xué)晶格在光片照明顯微鏡中的應(yīng)用由單個(gè)貝??塞爾光束與多個(gè)貝塞爾光

浙江大學(xué)碩士專(zhuān)業(yè)學(xué)位論文?１緒論??個(gè)分立且彼此之間的距離小到一定程度時(shí)的貝塞爾光束彼此干涉的結(jié)果［２２】。在光片照明顯??微鏡中的應(yīng)用，光學(xué)晶格將原本聚焦的光束分為了空間分布的陣列，極大地降低了照射到??樣品上的功率。對(duì)于晶格光片照明顯微鏡，當(dāng)入射樣品的激光總功率一定時(shí)，晶格光片照??明顯微鏡相比于普通的光片照明顯微鏡，會(huì)提供更高的軸向分辨率，并極大地降低對(duì)樣品??的光漂白與光損傷［２３］。??■??圖１－３光學(xué)晶格橫向截面強(qiáng)度??１．２．１．３艾利光束??艾利光束也是一種抗衍射光束，如圖１－４?（ａ）所示。但是不同于貝塞爾光束及其各種??變體，艾利光束不由錐形分布的光矢量疊加而成｜２＜２５１。艾利光束最明顯的特征為在傳播時(shí)，??雖然艾利光束的橫截面強(qiáng)度保持不變，但是傳播的路徑為曲線。正因?yàn)槿绱�，艾利光束�??被稱(chēng)為“自加速光束”［２６］。與貝塞爾光束相同，艾利光束也具有自愈合特性，所以艾利光??束在散射較強(qiáng)的介質(zhì)中成像時(shí)往往具有相對(duì)普通高斯光片好的多的結(jié)果。在光片照明顯微??鏡中，艾利光束的這些特性可以被用來(lái)產(chǎn)生很薄的光片，提供成像所需的高分辨率，甚至??可以產(chǎn)生各向同性的空間分辨率［２７１。??艾利光片效率最高的產(chǎn)生方式是用空間光調(diào)制器產(chǎn)生如圖１－４?（ｂ）所示的立方相位，??并結(jié)合掃描光束產(chǎn)生虛擬光片的方法。此外，使用傾斜的平凸柱面鏡或者一維立方相位掩??模板也可以用來(lái)直接產(chǎn)生艾利光片［２８１。??艾利光片可以提供同等分辨率下高斯光片十倍以上的視常此外，艾利光束不需要像??貝塞爾光束，利用額外的方法，如滾動(dòng)曝光等方式消除旁瓣的影響。艾利光束的旁瓣所產(chǎn)??生的影響只需要通過(guò)反卷積的方式就可以消除，且反卷積后


本文編號(hào)：3030116