【摘要】：全球艾滋病的盛行已經(jīng)導(dǎo)致有3900多萬人死亡,目前更有3690萬人艾滋病病毒感染者�，F(xiàn)階段常用的診斷技術(shù)主要是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)以及蛋白質(zhì)免疫印跡(WB),但是這些方法消耗時(shí)間長,技術(shù)復(fù)雜,不適合在實(shí)驗(yàn)室外進(jìn)行。而艾滋病主要在一些低中、收入國家廣泛流行,因此這些方法都不能廣泛的作為艾滋病的檢測手段。同時(shí)與核酸檢測相比較,常規(guī)的抗原抗體都不能用于檢測母親感染艾滋后生產(chǎn)的嬰兒,而嬰兒檢測的金標(biāo)準(zhǔn)方法只能是核酸檢測,目前尚沒有在貧困地區(qū)檢測HIV-1 DNA可行的方法。本文我們開發(fā)了一種結(jié)合重組聚合酶擴(kuò)增(RPA)的可穿戴微流控裝置,利用人體體溫能夠快速的擴(kuò)增HIV-1 DNA到可檢測的水平。由于人體手腕處的溫度波動范圍在33-34℃,滿足RPA擴(kuò)增所需的溫度條件,結(jié)合基于手機(jī)的熒光檢測系統(tǒng),這種方法能夠在24分鐘內(nèi)定量的檢測到102-105 copies/mL的HIV-1 DNA,并且線性度達(dá)到了 0.98。這些結(jié)果表明這種可穿戴的核酸檢測方法在時(shí)間與方便程度上優(yōu)于傳統(tǒng)的PCR手段以及其他的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù),這種檢測方法也能夠適用于貧困地區(qū)的HIV-1 DNA檢測,以及對其他的傳染性病原體進(jìn)行臨床監(jiān)測。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：TH77
【圖文】：

可能在貧窮地區(qū)實(shí)現(xiàn)［１８，邋１９］。逡逑近年來，有科學(xué)家通過在微流體芯片中，通過ｍＥＬＩＳＡ可以自動檢測全血中逡逑的ＣＤ４Ｔ淋巴細(xì)胞數(shù)量（如圖１．２Ａ）［２０］。一些新的隨著傳感器技術(shù)的快速發(fā)展，逡逑很多科學(xué)家使用電子傳感器進(jìn)行ＣＤ４Ｔ淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)。在微流體芯片中，根據(jù)逡逑ＣＤ４邋Ｔ淋巴細(xì)胞的電學(xué)特點(diǎn)如膜電位以及物理特性如細(xì)胞大小等特點(diǎn)對ＣＤ４邋Ｔ淋逡逑巴細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)［１９，邋２１］。在捕獲通道中修飾有人ＣＤ４Ｔ淋巴細(xì)胞的抗體，當(dāng)所有逡逑細(xì)胞經(jīng)過捕獲通道之后ＣＤ４Ｔ淋巴細(xì)胞會被抗體結(jié)合固定在通道中，其余細(xì)胞會逡逑通過捕獲通道，在捕獲通道的進(jìn)出口出的傳感器分別可以計(jì)算出進(jìn)出捕獲通道中逡逑的細(xì)胞數(shù)目，通過前后的數(shù)量差異即可得到ＣＤ４Ｔ淋巴細(xì)胞的數(shù)量（圖１．２邋Ｂ）逡逑［２１］。這種方法的檢測限可以低至９ｃｅｌｌｓ／ｐＬ，并且在細(xì)胞濃度為１００－７００ｃｅｌｌｓ／ｎＬ逡逑時(shí)與顯微鏡計(jì)數(shù)的結(jié)果有很強(qiáng)的相關(guān)性（Ｒ２＝邋０．９９７）。但是這種方法需要先將全逡逑血中的紅細(xì)胞裂解，防止高濃度的紅細(xì)胞對計(jì)數(shù)結(jié)果的干擾。陰影成像技術(shù)是利逡逑用光學(xué)的原理將細(xì)胞進(jìn)行投影放大到傳感器上

？＊．邋Ｃ0＝Ｃ00＾0邋？、…邐．．丨Ａ邐Ｇ逡逑＼ａｍｋ）＼■逡逑圖１．２邋ＣＤ４Ｔ淋巴細(xì)胞的自動化計(jì)數(shù)系統(tǒng)逡逑抗原抗體檢測技術(shù)：Ｐ２４是ＨＩＶ的特異性抗原，在感染早期未出現(xiàn)抗體時(shí)有逡逑低水平的表達(dá)量，因此通常被用為ＨＩＶ早期的特異性診斷［３，邋２４，邋２５］。Ｐ２４抗原檢逡逑測最常用的是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ｅｎｚｙｍｅ邋ｌｉｎｋｅｄ邋ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ邋ａｓｓａｙ，邋ＥＬＩＳＡ邋）（圖逡逑１．３）。樣本先用特定的裂解液裂解之后在１００°Ｃ下培養(yǎng)５分鐘用于從ＨＩＶ病毒顆逡逑粒中釋放出Ｐ２４抗原，之后與修飾有辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素的特定抗逡逑體結(jié)合，出現(xiàn)的顏色變化用于特異性檢測Ｐ２４抗原，并且顏色的深淺反應(yīng)了邋Ｐ２４逡逑抗原的含量［２６］。感染早期產(chǎn)生的Ｐ２４抗原含量很少，并且在病情發(fā)展過程中抗逡逑原抗體會形成復(fù)合物阻礙Ｐ２４抗原檢測，導(dǎo)致這種檢測方法的靈敏度不是很高，逡逑只能達(dá)到１０－１５ｐｇ／ｍＬ。雖然目前使用納米金顆粒［２７］、血漿ＥＬＩＳＡ［２８】等方法能逡逑夠很大的提高Ｐ２４的檢測限

要少量的樣本（１００邋ｐＬ）即可實(shí)現(xiàn)檢測［３８，邋４２］。但是這種方法的檢測限只能達(dá)到逡逑５，０００邋ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于標(biāo)準(zhǔn)的ＰＣＲ方法（２０－５０邋ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ邋），只能應(yīng)用于一些逡逑具有較高病毒載量的病人［３８］（圖１．４）。逡逑Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ邋ｆｏｒ邋ｒｅａｄｉｎｇ逡逑Ｐｒｉｃｋｈｅｅｌ＊＾｜Ｐ＾＾＾逡逑Ｓｅｐａｒａｔｏｒ邋＾邋ｆ逡逑Ｓａｍｐｌｅ邋ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ逡逑ｍｏｄｕｌｅ邋（ＳＩＭ）邐＿：邋＇逡逑圖１．４基于微流體芯片的自動化ＰＣＲ儀逡逑１．１．２恒溫檢測技術(shù)逡逑由于ＰＣＲ需要一個復(fù)雜的溫度循環(huán)系統(tǒng)，需要依靠一個大型的ＰＣＲ儀才能逡逑實(shí)現(xiàn)，且反應(yīng)時(shí)間較長，在基層醫(yī)院以及貧困地區(qū)很難大規(guī)模推廣實(shí)現(xiàn)。為了解逡逑決這一難題，科學(xué)家研發(fā)出了恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，通過酶的作用實(shí)現(xiàn)ＤＮＡ雙鏈之間逡逑的氫鍵斷裂與連接，取代了邋ＰＣＲ中的溫度變化條件，與ＰＣＲ相比具有快速、高逡逑效，且不依賴于專門的大型儀器等特點(diǎn)。目前常用的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)主要有環(huán)介導(dǎo)逡逑恒溫?cái)U(kuò)增（Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ邋ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，邋ＬＡＭＰ邋）邋［４０，邋４３－４５］，鏈替代擴(kuò)逡逑增（Ｓｔｒａｎｄ邋ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，邋ＳＤＡ邋）邋［４６＿４８］，依賴解旋酶的恒溫基因擴(kuò)增逡逑（Ｈｅｌｉｃａｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｉｓｏｔｈｅｒｍａ丨邋ＤＮＡ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ

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本文編號：2788828