發(fā)布時間：2020-06-12 00:21

【摘要】：在過去的二十年中,由于其獨(dú)特的光學(xué)特性,能夠引起局域表面等離子體共振(LSPR)散射和吸收的貴金屬納米顆粒(MNP)已經(jīng)引起相當(dāng)大的關(guān)注,并已經(jīng)在材料科學(xué),化學(xué)以及生物傳感,疾病診斷和治療等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。目前針對MNP已經(jīng)開發(fā)了許多顯微成像技術(shù),如暗場顯微術(shù),微分干涉相差顯微術(shù),正交偏振顯微術(shù),熱成像以及瞬態(tài)吸收成像等。但與熒光信號不同的是,LSPR的檢測信號與入射光信號具備相同的檢測波長,因此無法通過濾光片消除背景,導(dǎo)致對單粒子散射檢測的嚴(yán)重干擾。據(jù)我們所知,迄今為止,在高瑞利散射背景系統(tǒng)(如毛細(xì)管,三維細(xì)胞或組織成像)中還沒有令人滿意的成像模式。最近,由于其在光學(xué)切片活體生物樣品如胚胎,細(xì)胞和組織中運(yùn)用,光片顯微鏡或平面照明顯微鏡(SPIM)已經(jīng)獲得了眾多研究者的關(guān)注。在典型的SPIM設(shè)置中,通過一系列光學(xué)器件的薄片光以90度照射樣品,同時也垂直于收集發(fā)射光的物鏡光軸。這樣有兩個明顯的優(yōu)勢,第一,當(dāng)光片的厚度與透鏡焦點(diǎn)的深度相匹配時,理論上在焦平面外的樣本將不會被照射,導(dǎo)致沿垂直方向具有高分辨率的圖像,最小離焦背景和最小的瑞利散射背景;第二,由于入射光垂直于檢測物鏡,激發(fā)光并不會進(jìn)入物鏡收集,從而導(dǎo)致極低的背景,也就是天然享有暗場顯微鏡的優(yōu)勢。然而,現(xiàn)有的SPIM設(shè)置都是以熒光顯微鏡為基礎(chǔ)開發(fā)的,目前還沒有關(guān)于光片LSPR散射成像的報道。本文針對上述問題進(jìn)行研究,主要包括以下內(nèi)容:(1)以傳統(tǒng)光片照明顯微鏡的原理為基礎(chǔ),對光源,探測器等光學(xué)元件進(jìn)行了優(yōu)化,采用超連續(xù)激光為光源,研制出具有高靈敏度,高信噪比,高時空分辨率和各向異性分辨率的光片LSPR散射成像技術(shù)。每個光學(xué)元件的優(yōu)化和儀器的設(shè)計(jì)都是在經(jīng)典瑞利散射公式的指導(dǎo)下進(jìn)行的。利用光片照射技術(shù),我們將其與毛細(xì)管系統(tǒng)結(jié)合起來,實(shí)現(xiàn)了毛細(xì)管中MNP粒子的成像,并獲取毛細(xì)管中納米粒子信息的一些信息,包括散射光強(qiáng)度,光譜,數(shù)量等。鑒于等離激元金屬納米顆粒在各個領(lǐng)域的應(yīng)用快速增長,我們預(yù)計(jì)這種高靈敏度和高通量等離子體激元成像技術(shù)可能有助于表征和評估MNPs以及它們與周圍環(huán)境的動態(tài)相互作用。(2)為了實(shí)現(xiàn)對嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥(SRAS)的超高靈敏度分析,基于金納米顆粒優(yōu)良的光學(xué)性質(zhì)和生物相容性,利用我們所搭建的單層超連續(xù)激光光片顯微鏡,我們成功實(shí)現(xiàn)了在單分子水平上對與SRAS相關(guān)的DNA序列的檢測。該技術(shù)是是利用Au-ssDNA納米粒子探針與溶液中目標(biāo)ssDNA雜交形成聚合體的效應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的。應(yīng)用所搭裝置對散射信號的收集,對DNA雜交前后的顆粒進(jìn)行成像并計(jì)數(shù),通過對18 nm金顆粒數(shù)目減少量的統(tǒng)計(jì)實(shí)現(xiàn)了對目標(biāo)DNA濃度的檢測。此外,由于核酸外切酶I(Exo I)對于DNA的復(fù)制、重組、修復(fù)起著重要作用,我們利用所搭建的單層超連續(xù)激光光片顯微鏡,發(fā)展了一種高效、快速的方法對酶濃度進(jìn)行了檢測。其檢測原理是基于核酸外切酶I對DNA的酶切反應(yīng)會誘導(dǎo)13 nm金顆粒發(fā)生團(tuán)聚反應(yīng)。利用我們所搭建的裝置對金顆粒團(tuán)聚體進(jìn)行單分子成像并計(jì)數(shù),發(fā)現(xiàn)酶濃度的對數(shù)值與13 nm金顆粒聚集體數(shù)目具有良好的線性關(guān)系。(3)利用我們所搭建的激光單層照明光片成像系統(tǒng),結(jié)合毛細(xì)管-缺口管陣列進(jìn)樣系統(tǒng),對單個金納米棒在氧化過程中的動力學(xué)行為進(jìn)行考察,通過分析其顏色、強(qiáng)度、光譜、電遷移率等變化趨勢,我們發(fā)現(xiàn)了表面帶有不同修飾物的金納米棒的氧化行為的差異以及金納米棒在氧化過程中表面帶電量的變化,進(jìn)一步揭示了金納米棒的氧化反應(yīng)機(jī)理。(4)由于細(xì)胞內(nèi)流體粘度與生命運(yùn)行以及疾病的發(fā)生密切相關(guān),而目前能夠?qū)崿F(xiàn)活細(xì)胞成像的粘度探針還比較少,因此,我們結(jié)合金納米探針優(yōu)異的光學(xué)性能以及良好的生物相容性,利用我們所搭建的激光單層光片成像系統(tǒng),對細(xì)胞微環(huán)境中金納米粘度探針的構(gòu)建進(jìn)行探索。在此,我們研究了溶液粘度對金納米棒轉(zhuǎn)動的影響,推導(dǎo)了相關(guān)公式并發(fā)現(xiàn)金納米棒的轉(zhuǎn)動行為與環(huán)境粘度具備線性相關(guān)。(5)創(chuàng)建和擴(kuò)大色差和提高數(shù)字成像的色彩分辨率對于更好地應(yīng)用色彩分析至關(guān)重要。在此,我們通過使用自制的可調(diào)諧多波段激光照明裝置開發(fā)了新的顏色調(diào)制分析策略,其中照明光的R,G和B分量的部分可以任意調(diào)節(jié),并且因此可以連續(xù)調(diào)節(jié)樣本在RGB色彩空間中的顏色。與傳統(tǒng)的連續(xù)光源照明不同,多波段激光照明可以擴(kuò)大樣品之間的顏色分離,因此可以在顏色分析中獲得高光譜靈敏度。使用該儀器采用單個Ag@AuNR作為硫化物探針,我們實(shí)現(xiàn)了硫化物的高通量和高靈敏度檢測,檢測限為0.1 nM,比傳統(tǒng)的紫外檢測模式提高了2個數(shù)量級以上。該策略可用于生物成像和生物化學(xué)分析中的納米顆粒識別,評估和測定,并有望用于人臉識別和防偽技術(shù)中。
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：TH742

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本文編號：2708708