本文關(guān)鍵詞：工業(yè)無(wú)線網(wǎng)絡(luò)路由及通信調(diào)度的實(shí)現(xiàn)與優(yōu)化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】目的：基于肝癌的發(fā)病機(jī)制與細(xì)胞增殖和凋亡的失衡密切相關(guān)，以P53、Bax、Bcl-2與肝癌細(xì)胞凋亡明確相關(guān)的基因?yàn)榍腥朦c(diǎn)，進(jìn)行相關(guān)研究，觀察牛黃參（NHS）含藥血清體外誘導(dǎo)人肝癌細(xì)株HepG2細(xì)胞凋亡的作用，初步探討其作用機(jī)制，為牛黃參膠囊的研究與應(yīng)用提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)以及為臨床治療原發(fā)型肝癌開(kāi)辟一條新思路。方法：采用藥物血清學(xué)和細(xì)胞藥理學(xué)方法，對(duì)比觀察（陰性無(wú)藥物血清對(duì)照、陽(yáng)性藥CTX對(duì)照）NHS含藥血清對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)調(diào)控基因Bax，Bc1-2及抑癌基因P53的影響。主要觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法如下：1．含藥血清的制備：40只SD大鼠，隨機(jī)分為空白對(duì)照組（8只）、CTX含藥血清組（8只）和牛黃參含藥血清組（24只）。以成人臨床一日常用量為含藥血清組的有效劑量，按人和大鼠體表面積折算的等效劑量比值換算出大鼠的一日用藥劑量，并設(shè)為含藥血清組終劑量�？瞻讓�(duì)照組：灌服等效生理鹽水每天兩次，每次5mL。含藥血清組：CTX水溶液（25.2mg/kg）每天灌胃兩次，每次5mL；牛黃參煎液（1.07g/kg）每天灌胃兩次，每次5mL；重復(fù)給藥連續(xù)七天，末次給藥45分鐘后采取心臟穿刺采血法取血，將采集的血液在室溫中靜置4h，3000rpm，離心15min，收集血清，將收集的血清在56℃水浴30min進(jìn)行滅活，而后在超凈臺(tái)內(nèi)用0.22pm微孔濾膜過(guò)濾除菌，將血清移至干凈試管中，置-20℃保存?zhèn)溆�，需要時(shí)用培養(yǎng)液配制成所需濃度的含藥血清。2．以CCK-8法檢查五個(gè)藥物血清濃度對(duì)IIepC2細(xì)胞增殖的抑制作用，從中找出NHS的最佳有效藥物血清濃度。3．HepG2細(xì)胞NHS含藥血清給藥48h后，AO/EB和DAPI熒光染色，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。4．流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV-FITC/PI雙染色法檢測(cè)NHS含藥血清對(duì)HepG2細(xì)胞周期和凋亡百分率影響。5．蛋白質(zhì)印跡法（WesternBlot）檢測(cè)NHS含藥血清對(duì)HepG2細(xì)胞的P53、Bcl-2基因蛋白表達(dá)的影響。6．免疫組化方法檢測(cè)NHS含藥血清三個(gè)有效藥物濃度對(duì)HepG2細(xì)胞Bcl-2,Bax及細(xì)胞核增殖性抗原(PCNA)表達(dá)的影響。7．RealtimeRT-PCR檢測(cè)含藥血清處理前、后的HepG2細(xì)胞中Bcl-2和BaxmRNA的相對(duì)表達(dá)。結(jié)果：1.CTX組及牛黃參各濃度組細(xì)胞增殖受到明顯抑制，且隨著濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)，HepG2細(xì)胞的增殖數(shù)目和速度下降，牛黃參各濃度組與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。2.通過(guò)熒光顯微鏡觀察到典型的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變：含藥血清組部分的細(xì)胞核呈現(xiàn)折縫樣、波紋狀，核染色質(zhì)著桔紅色，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；CTX含藥血清組、20%NHS含藥血清組可見(jiàn)大量不同程度的壞死和凋亡細(xì)胞，其細(xì)胞體積變小，核膜消失，胞質(zhì)內(nèi)空泡增多，細(xì)胞器較少，細(xì)胞核染色質(zhì)固縮，形態(tài)不規(guī)則，可見(jiàn)核碎裂，產(chǎn)生凋亡小體，，且培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，改變?cè)斤@著。3．流式細(xì)胞儀分析HepG2細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的亞二倍體凋亡峰，且細(xì)胞凋亡數(shù)量隨著給藥劑量的增加而增加。HepG2細(xì)胞在CTX含藥血清、5%NHS含藥血清、10%NHS含藥血清和20%NHS含藥血清給藥48h后，凋亡細(xì)胞所占比例分別為30.13%、11.05%、19.76%和28.32%。細(xì)胞周期分析說(shuō)明NHS含藥血清組使該細(xì)胞生長(zhǎng)阻止于G0/G1期。4．蛋白質(zhì)印跡法(WesternBlot)結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，牛黃參含藥血清作用HepG2細(xì)胞后，Bcl-2蛋白的表達(dá)量顯著下降（P<0.05），P53蛋白的表達(dá)量顯著上升（P<0.05），且兩兩組間相比有顯著性差異（P<0.05）。5．免疫組化結(jié)果顯示：隨著NHS含藥血清給藥濃度的增加，PCNALI逐漸降低，表明NHS含藥血清可抑制HepG2腫瘤細(xì)胞的增殖，且隨著NHS含藥血清濃度增加，能夠明顯降低HepG2細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率，Bax蛋白表達(dá)呈中強(qiáng)性表達(dá)，20%NHS、CTX組和10%NHS組陽(yáng)性表達(dá)率分別為56.89%，58.33%，44.73%，與空白對(duì)照組比較，具有顯著性差異(P<0.01，P<0.05)。6．實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞的CT值，分析各細(xì)胞凋亡相關(guān)因子mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯示,隨著NHS含藥血清濃度的增加BaxmRNA的表達(dá)水平增加，而B(niǎo)cl-2mRNA的表達(dá)水平卻降低。結(jié)論：1.NHS含藥血清能在一定程度上抑制HepG2細(xì)胞的增殖。2.NHS含藥血清具有誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的作用。3.NHS含藥血清誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制之一可能是上調(diào)促凋亡基因Bax和P53的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。
【作者】白山嶺；
【導(dǎo)師】趙映前；
【作者基本信息】湖北中醫(yī)藥大學(xué)，中醫(yī)臨床基礎(chǔ)，2014，博士
【關(guān)鍵詞】牛黃參；HepG2；P53；Bcl-2；Bax；基因調(diào)控；細(xì)胞凋亡；

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  本文關(guān)鍵詞：工業(yè)無(wú)線網(wǎng)絡(luò)路由及通信調(diào)度的實(shí)現(xiàn)與優(yōu)化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。