疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶（Thermomyces lanuginosus lipase,TLL）由于具有熱穩(wěn)定性好、催化活性高、耐堿性等特點(diǎn),在生物柴油、洗滌劑、食品、化妝品、皮革、醫(yī)藥和環(huán)境等領(lǐng)域作為工業(yè)催化劑應(yīng)用廣泛。然而,工業(yè)生產(chǎn)對脂肪酶的活性和耐受性有著極其嚴(yán)苛的要求,對TLL進(jìn)行性質(zhì)的優(yōu)化能夠克服其應(yīng)用瓶頸,降低其生產(chǎn)成本。為了提高TLL的催化活性等性質(zhì),本研究利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和點(diǎn)飽和突變技術(shù)以及定點(diǎn)突變技術(shù)對TLL的催化活性及穩(wěn)定性進(jìn)行分子改造,產(chǎn)生的TLL突變體被證明具有良好的催化活性并且能夠很好的應(yīng)用到生物柴油工藝中。1.我們利用半理性設(shè)計(jì),通過點(diǎn)飽和突變技術(shù)對TLL進(jìn)行分子改造。選取TLL上的三個氨基酸位點(diǎn)（G23,D62,D96）進(jìn)行三點(diǎn)飽和突變,完成了5760個突變體的篩選,得到12個酶活提高的的突變體。（1）通過分析突變體的性質(zhì),我們發(fā)現(xiàn)TLL的第96位氨基酸與其催化活性和酶學(xué)性質(zhì)關(guān)系緊密,且G23,D62,D96這三個位點(diǎn)的復(fù)合突變可以獲得酶學(xué)性質(zhì)更加豐富的突變體。（2）且突變體G23A/D62K/D96H、D62R/D96E、D96Q、D96M、D96K、D... 

【文章來源】：云南師范大學(xué)云南省

【文章頁數(shù)】：109 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

脂肪酶催化甘油三酯水解示意圖

第1章緒論3解酶，它的二級結(jié)構(gòu)僅包含6條β折疊片和5條α螺旋[19]。脂肪酶是一類絲氨酸水解酶，其催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)與絲氨酸蛋白酶家族類似，活性中心都由一個親核殘基絲氨酸，一個酸性氨基酸天冬氨酸或谷氨酸和一個堿性氨基酸組氨酸構(gòu)成（Ser-Asp/Glu-His）[18]。在脂肪酶的二級結(jié)構(gòu)中，催化三聯(lián)體的Ser位于β5折疊片之后、α螺旋之前，形成的β轉(zhuǎn)角-α螺旋結(jié)構(gòu)稱之為親核肘（Nucleophileelbow），Asp/Glu位于β7折疊片后，His一般位于最后一個β折疊片之后[20]。不同脂肪酶的二級結(jié)構(gòu)在α/β水解酶基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)上有所不同，通過不同數(shù)量的α螺旋和β折疊、不同分布的α螺旋以及不同彎曲程度的β折疊構(gòu)成不同的二級結(jié)構(gòu)，從而使不同微生物脂肪酶具有不同的底物結(jié)合位點(diǎn)，表現(xiàn)出不同催化特性。圖1.2典型的α/β水解酶折疊結(jié)構(gòu)示意圖Figure1.2Schematicstructureofα/βhydrolasefold絲氨酸蛋白酶家族的催化三聯(lián)體位于其分子表面，而大多數(shù)脂肪酶的催化三聯(lián)體卻隱藏在一段α螺旋結(jié)構(gòu)之下，這個結(jié)構(gòu)被稱為脂肪酶的“蓋子”（Lid）[21]。這個特殊的蓋子結(jié)構(gòu)是由一段具有雙親性的α螺旋結(jié)構(gòu)組成，即α螺旋兩側(cè)分別由親水性氨基酸和疏水性氨基酸組成，并且親水一側(cè)面向朝外，疏水一側(cè)面向活性中心進(jìn)行保護(hù)。蓋子結(jié)構(gòu)很好的解釋了脂肪酶的催化機(jī)制。

TLL脂肪酶蓋子開放和關(guān)閉的結(jié)構(gòu)示意[26]

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]基于蛋白質(zhì)折疊自由能分析的定點(diǎn)突變提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶熱穩(wěn)定性[J]. 童理明,劉松,李江華,堵國城,陳堅(jiān).  食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2018(12)
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[4]基于磁性納米載體的固定化脂肪酶在生物柴油中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 張瑋瑋,楊慧霞.  石油化工應(yīng)用. 2017(12)
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碩士論文
[1]通過定點(diǎn)突變提高伯克霍爾德菌脂肪酶的熱穩(wěn)定性的研究[D]. 董盼盼.福建師范大學(xué) 2018
[2]熱泉菌Bacillus sp.BI-19產(chǎn)耐高溫脂肪酶的基因克隆及其酶學(xué)性質(zhì)研究[D]. 劉秀萌.山東大學(xué) 2016
[3]A. niger Li-38產(chǎn)脂肪酶及其催化棉籽油合成生物柴油的研究[D]. 唐鳳仙.石河子大學(xué) 2008
[4]Geotrichum sp. SYBC WU-3產(chǎn)脂肪酶發(fā)酵條件優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)研究[D]. 王蕾.江南大學(xué) 2008



本文編號：3572801