本文關(guān)鍵詞：象耳豆根結(jié)線蟲MeCPI基因的分離與鑒定

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【摘要】：象耳豆根結(jié)線蟲(Meloidogyne enterolobii)寄主范圍廣,繁殖率高,致病力強(qiáng),可寄生攜帶Mi抗性基因的番茄(Solanum lycopersicum)和辣椒(Capsicum frutescens)。如今,象耳豆根結(jié)已成為全球熱帶、亞熱帶地區(qū)作物的一個(gè)重要病原物。該線蟲在我國南方地區(qū)分布較廣,且嚴(yán)重危害多種作物,目前已在20多種經(jīng)濟(jì)作物及多種熱帶水果上分離到該線蟲。象耳豆根結(jié)線蟲在其寄生過程中,向寄主植物細(xì)胞中分泌多種由線蟲食道腺細(xì)胞表達(dá)的效應(yīng)子蛋白,分離和鑒定這些效應(yīng)子蛋白的功能有助于理解象耳豆根結(jié)線蟲的分子致病機(jī)理。本文通過同源克隆的方法,克隆到象耳豆根結(jié)線蟲的一個(gè)半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因MeCPI,并通過原位雜交、齡期表達(dá)、體外RNAi和瞬時(shí)表達(dá)等方法,初步分析了MeCPI的功能。1.經(jīng)同源克隆得到了象耳豆根結(jié)線蟲的MeCPI基因。該基因的cDNA全長為444bp,DNA全長為1543bp,含有4個(gè)內(nèi)含子。MeCPI基因編碼的蛋白質(zhì)含有147個(gè)氨基酸殘基,用SignalP預(yù)測該蛋白含有信號肽序列。該蛋白含有一個(gè)半胱氨酸蛋白酶抑制劑蛋白保守結(jié)構(gòu)域。2.通過原位雜交的技術(shù),研究了MeCPI基因在象耳豆根結(jié)線蟲侵染前二齡幼蟲中的定位。結(jié)果顯示,該基因在象耳豆根結(jié)線蟲的背食道腺部位表達(dá)。3.qRT-PCR結(jié)果表明,MeCPI基因在四齡幼蟲階段表達(dá)量最高,在三齡幼蟲階段也有較高的表達(dá)量,而在卵和侵染前二齡幼蟲階段表達(dá)量非常低。表明MeCPI基因的功能與象耳豆根結(jié)線蟲的寄生有關(guān)。4.通過體外浸泡法沉默MeCPI基因后,發(fā)現(xiàn)相對于用ddH2O處理的對照組,實(shí)驗(yàn)組的成熟雌蟲數(shù)量明顯減少,同樣說明MeCPI基因的功能與象耳豆根結(jié)線蟲的寄生有關(guān)。5.通過煙草瞬時(shí)表達(dá)MeCPI基因,用Western-blot檢測到該基因cDNA全長和去信號肽片段所表達(dá)的蛋白,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供可參考的依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：象耳豆根結(jié)線蟲 效應(yīng)子蛋白 MeCPI 原位雜交 RNAi
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S432.45
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-6
• 縮寫詞及英文對照6-10
• 1 前言10-20
• 1.1 根結(jié)線蟲及其危害10
• 1.2 根結(jié)線蟲的生活史10-12
• 1.3 根結(jié)線蟲的防治12
• 1.4 植物寄生線蟲效應(yīng)子蛋白的研究概況12-15
• 1.4.1 植物寄生線蟲的效應(yīng)子蛋白12-13
• 1.4.2 降解或修飾細(xì)胞壁13
• 1.4.3 參與調(diào)控寄主細(xì)胞代謝和信號途徑13-14
• 1.4.4 抑制寄主的防衛(wèi)反應(yīng)14-15
• 1.4.5 半胱氨酸蛋白酶抑制劑蛋白的研究概況15
• 1.5 植物寄生線蟲效應(yīng)蛋白功能的研究方法15-19
• 1.5.1 常用研究方法概述15
• 1.5.2 RNAi在植物寄生線蟲研究中的應(yīng)用15-17
• 1.5.3 原位雜交技術(shù)和齡期表達(dá)17-18
• 1.5.4 瞬時(shí)表達(dá)18
• 1.5.5 酵母雙雜交18-19
• 1.6 研究目的及內(nèi)容19-20
• 2 材料與方法20-41
• 2.1 材料20-22
• 2.1.1 供試線蟲種群和植物20
• 2.1.2 菌株及載體20
• 2.1.3 主要試劑及試劑盒20
• 2.1.4 主要溶液配方20-21
• 2.1.5 主要培養(yǎng)基配方21
• 2.1.6 主要儀器21-22
• 2.2 方法22-41
• 2.2.1 象耳豆根結(jié)線蟲總RNA的提取22
• 2.2.2 象耳豆根結(jié)線蟲基因組DNA的提取22-23
• 2.2.3 象耳豆根結(jié)線蟲MeCPI基因cDNA的獲得23
• 2.2.4 象耳豆根結(jié)線蟲Me-CPI基因EST序列的獲得23-28
• 2.2.5 MeCPI基因在象耳豆根結(jié)線蟲不同發(fā)育階段的表達(dá)量分析28-31
• 2.2.6 MeCPI基因的體外RNAi31-33
• 2.2.7 MeCPI基因的原位雜交33-35
• 2.2.8 瞬時(shí)表達(dá)35-41
• 3 結(jié)果41-51
• 3.1 MeCPI基因的克隆及序列分析41-45
• 3.2 原位雜交45-46
• 3.2.1 雜交探針的合成45
• 3.2.2 原位雜交結(jié)果45-46
• 3.3 MeCPI基因在象耳豆根結(jié)線蟲不同發(fā)育階段表達(dá)量的分析46-47
• 3.4 體外浸泡RNAi47-49
• 3.4.1 MeCPI基因dsRNA的合成47-48
• 3.4.2 qRT-PCR對MeCPI沉默效果的檢測48-49
• 3.4.3 體外RNAi對象耳豆根結(jié)線蟲侵染力的影響49
• 3.5 MeCPI基因的煙草瞬時(shí)表達(dá)49-51
• 3.5.1 植物表達(dá)載體的構(gòu)建49
• 3.5.2 工程農(nóng)桿菌的PCR鑒定49-50
• 3.5.3 Western-blot檢測50-51
• 4 結(jié)論與討論51-55
• 4.1 結(jié)論51
• 4.2 討論51-55
• 4.2.1 MeCPI基因的克隆51-52
• 4.2.2 MeCPI基因的定位與齡期表達(dá)52
• 4.2.3 MeCPI基因的體外RNAi52-53
• 4.2.4 MeCPI基因的瞬時(shí)表達(dá)53-54
• 4.2.5 本研究需進(jìn)一步解決的問題54-55
• 致謝55-56
• 參考文獻(xiàn)56-60
• 附錄60-61

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 扈麗麗;卓侃;林柏榮;廖金鈴;;植物寄生線蟲效應(yīng)蛋白功能分析方法的研究進(jìn)展[J];中國生物工程雜志;2016年02期

2 牛俊海;郭仰東;簡恒;;RNA干擾在植物抗根結(jié)線蟲病基因工程應(yīng)用中的研究進(jìn)展[J];基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué);2009年01期

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本文編號：892831