發(fā)布時間：2017-09-17 15:12

  本文關鍵詞：雞羽毛降解菌株的分離鑒定及其發(fā)酵條件和降解效果的研究

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【摘要】：羽毛是重要的蛋白質資源,其蛋白含量在80%以上,主要成分為角蛋白。但由于角蛋白是一種具有極強抗性,難以生物降解的硬蛋白,難以直接利用,而傳統(tǒng)的物理和化學加工方法不僅消耗大量能源,還引發(fā)嚴重的二次污染問題。目前我國養(yǎng)殖業(yè)中每年產(chǎn)生百萬余噸羽毛廢棄物,且其數(shù)量還將增長,隨著蛋白資源緊缺程度的加劇和我國經(jīng)濟的發(fā)展,亟需實現(xiàn)廢棄角蛋白的高值轉化和循環(huán)利用,而微生物降解羽毛角蛋白既能對羽毛廢棄物進行無害化處理,又能實現(xiàn)角蛋白資源的轉化利用,從而實現(xiàn)羽毛廢棄物的變廢為寶,這將產(chǎn)生巨大的生態(tài)效益和經(jīng)濟效益。本研究首先采用以酪蛋白為唯一碳氮源的篩選培養(yǎng)基和以羽毛為唯一碳氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基對能夠降解羽毛的細菌進行初篩和復篩,以篩選培養(yǎng)基中酪蛋白降解圈和發(fā)酵培養(yǎng)基中羽毛是否降解作為判定依據(jù),從下水道、掩埋家禽尸體的泥土、花壇、魚塘等環(huán)境中分離和篩選出八株能高效降解羽毛的菌株:F-T1-2、X1、D1、T1、T3、Y2、T2、B1-2。通過形態(tài)學觀察、生化鑒定試驗和16S rDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析,最終判定:F-T1-2、T1、T3為蠟樣芽胞桿菌,X1、D1為甜菜假單胞菌,Y2、T2為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌,B1-2為銅綠假單胞菌。并測得各菌株發(fā)酵降解羽毛24 h發(fā)酵上清液粗酶液的角蛋白酶酶活力為T1:49.9 U/mL,T3:34.3 U/mL,F-T1-2:32.05U/mL,D1:23.1 U/mL,X1:35.6 U/mL,Y2:35.45 U/mL,T2:28.65 U/mL。迄今為止,國內外暫無甜菜假單胞菌、國內暫無銅綠假單胞菌降解角蛋白的報道,本研究為首次報道。以1%的羽毛為底物,測定菌株D1、T2、Y2、T3、B1-2、F-T1-2對羽毛的降解效率,進行了發(fā)酵條件的初步優(yōu)化,確定最佳發(fā)酵初始pH值分別為:D1和T2為pH=10,T3和B1-2為pH=11,Y2為pH=9,F-T1-2為pH=7;最佳發(fā)酵培養(yǎng)溫度分別為:D1和T2為27℃,F-T1-2、B1-2和Y2為37℃,T3為32℃。通過肉眼觀察各菌株降解羽毛過程中羽毛結構變化和發(fā)酵液性狀變化,并對F-T1-2降解的羽毛進行分時取樣和掃描電鏡觀察。肉眼觀察和電鏡掃描顯示發(fā)酵24h時,部分羽小枝脫落,部分羽枝脫落,羽毛梗表面鱗片結構開始脫落;發(fā)酵48h時,大部分羽小枝斷裂脫落,大部分羽枝脫落,羽毛梗鱗片下纖維結構暴露;發(fā)酵72h,羽枝劇烈斷裂,羽小枝幾乎消失,羽毛梗纖維撕裂、凹陷,羽毛梗內部蜂巢結構暴露;發(fā)酵192h,羽枝和羽小枝已完全降解,羽毛梗斷裂、分離,內部蜂巢結構完全暴露并開始溶解;發(fā)酵液隨著發(fā)酵時間延長變得褐色渾濁。因此推斷羽毛各部位的降解速度和容易程度順序為:羽小枝羽枝羽毛梗;簡要概括羽毛的降解過程為:羽毛降解菌附著→羽小枝完全降解→羽枝完全降解→羽毛梗完全降解。本研究分離獲得了八株高效的羽毛角蛋白降解菌,豐富了角蛋白降解菌的研究內容,為將來規(guī)�；挠鹈到狻⒋罅康慕堑鞍酌干a(chǎn)純化,甚至為重組基因工程菌株、構建高效生產(chǎn)菌株、開發(fā)新型蛋白酶品種打下基礎。
【關鍵詞】：角蛋白降解菌株 分離 鑒定 發(fā)酵條件 羽毛降解
【學位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：X172;X713
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 縮寫詞與英漢對照7-11
• 1 前言11-18
• 1.1 羽毛及角蛋白的結構與特性11-12
• 1.2 角蛋白降解菌的分類12-13
• 1.3 角蛋白酶的分類13-14
• 1.4 角蛋白的降解機制14-16
• 1.4.1 物理壓力理論14-15
• 1.4.2 硫解理論15
• 1.4.3 酶解理論15-16
• 1.5 羽毛角蛋白降解菌的分離與鑒定方法16-17
• 1.5.1 羽毛的處理與培養(yǎng)基的制備16
• 1.5.2 角蛋白降解菌的分離篩選16
• 1.5.3 菌株形態(tài)觀察和生理生化性質鑒定16-17
• 1.5.4 16S rDNA測定和系統(tǒng)發(fā)育樹分析17
• 1.6 本研究的目的與意義17-18
• 2 材料和方法18-24
• 2.1 材料18-19
• 2.1.1 羽毛的制備18
• 2.1.2 主要試劑18
• 2.1.3 主要儀器設備18
• 2.1.4 培養(yǎng)基18-19
• 2.1.5 實驗常用器械與耗材19
• 2.2 羽毛降解菌的分離、篩選和角蛋白酶酶活力測定19-20
• 2.2.1 樣品采集與富集培養(yǎng)19
• 2.2.2 羽毛降解菌的分離、篩選19
• 2.2.3 細菌生長速率測定19
• 2.2.4 角蛋白酶酶活力測定19-20
• 2.3 羽毛降解菌的菌種鑒定20-21
• 2.3.1 菌落和菌體的形態(tài)觀察20
• 2.3.2 生化特性鑒定20
• 2.3.3 細菌 16S rDNA序列測定與分析20-21
• 2.3.4 系統(tǒng)發(fā)育分析21
• 2.4 羽毛降解菌發(fā)酵條件的研究21-24
• 2.4.1 初始pH對羽毛降解的影響21-23
• 2.4.2 培養(yǎng)溫度對羽毛降解的影響23-24
• 2.5 羽毛降解過程的研究24
• 2.5.1 已降解與未降解羽毛的眼觀結構對比24
• 2.5.2 各菌株完全降解羽毛的時間24
• 2.5.3 羽毛降解過程中的顯微結構變化24
• 3 結果與分析24-60
• 3.1 篩選結果24-27
• 3.1.1 初篩平板生長狀況24-25
• 3.1.2 復篩發(fā)酵結果25-26
• 3.1.3 細菌生長速率測定結果26
• 3.1.4 角蛋白酶酶活力測定結果26-27
• 3.2 菌種鑒定結果27-39
• 3.2.1 菌株平板生長特征27-29
• 3.2.2 細菌菌體顯微形態(tài)29-31
• 3.2.3 細菌生化鑒定結果31-32
• 3.2.4 細菌 16S rDNA分析32-39
• 3.3 羽毛降解菌發(fā)酵條件的研究結果39-53
• 3.3.1 初始pH對羽毛降解的影響39-47
• 3.3.2 培養(yǎng)溫度對羽毛降解的影響47-53
• 3.4 發(fā)酵過程中羽毛的降解效果53-60
• 3.4.1 已降解與未降解羽毛的眼觀結構對比53
• 3.4.2 各菌株完全降解羽毛的時間53-55
• 3.4.3 羽毛降解過程中的顯微結構變化55-60
• 4 討論60-63
• 4.1 角蛋白降解菌株的分離與鑒定60-61
• 4.2 培養(yǎng)條件對羽毛降解的影響61-62
• 4.2.1 初始pH值對羽毛降解的影響61
• 4.2.2 培養(yǎng)溫度對羽毛降解的影響61-62
• 4.3 角蛋白降解菌降解羽毛的效果62-63
• 5 結論63-64
• 致謝64-65
• 參考文獻65-69
• 附錄 各分離菌株 16S rDNA序列69-74

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