本文關(guān)鍵詞：蝗綠僵菌MabrlA在產(chǎn)孢調(diào)控作用和致病機制中的功能研究

  更多相關(guān)文章： 蝗綠僵菌 C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 基因敲除 產(chǎn)孢 侵染致病能力

【摘要】：昆蟲病原真菌在農(nóng)業(yè)害蟲防治中作為重要的殺蟲真菌,其分生孢子是殺蟲真菌類農(nóng)藥的主要有效作用單元。因此,研究昆蟲病原真菌產(chǎn)孢調(diào)控,對于提高孢子產(chǎn)率和孢子質(zhì)量,進而促進殺蟲真菌農(nóng)藥應用具有重要作用。brlA編碼一種C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,在絲狀真菌產(chǎn)孢和菌絲生長調(diào)控中起著中心調(diào)控作用,與abaA和wet A共同組成調(diào)控產(chǎn)孢特異基因表達的brlA-abaA-wetA中心途徑。在構(gòu)巢曲霉中,敲除該基因后產(chǎn)孢功能喪失,菌絲呈短而硬的毛發(fā)狀。但是,在蝗綠僵菌中其功能沒闡明。本文實驗材料采用昆蟲病原真菌蝗綠僵菌,通過同源重組方法構(gòu)建基因敲除菌株和回復菌株對該基因的功能進行研究。主要研究結(jié)果如下:1.利用蝗綠僵菌全基因序列數(shù)據(jù)庫和全基因組文庫,克隆得到MabrlA全長cDNA序列與構(gòu)建敲除載體所用的左右臂(800bp以上)序列;構(gòu)建MabrlA基因敲除載體和回復載體,進行蝗綠僵菌的遺傳轉(zhuǎn)化,篩選得到目標轉(zhuǎn)化子;2.MabrlA的缺失影響蝗綠僵菌的產(chǎn)孢、抗逆特性和毒力。平板菌落和顯微觀察表明:敲除MabrlA后,蝗綠僵菌產(chǎn)孢減少(菌落生長減弱、產(chǎn)孢延遲、分枝數(shù)減少);逆境敏感性測定結(jié)果表明:敲除MabrlA孢子耐受性降低。經(jīng)UV-B照射處理,ΔMabrlA菌株的半抑制萌發(fā)時間比WT和CP的半抑制萌發(fā)時間提前2.8h;熱激處理后,ΔMabrlA菌株的半抑制萌發(fā)時間比WT和CP的半抑制萌發(fā)時間提前1.7h。在添加細胞壁破壞劑的培養(yǎng)基上,ΔMabrlA菌株耐受性降低。ΔMabrlA菌株細胞壁厚度極顯著增厚。3.在蝗綠僵菌中,利用定量PCR技術(shù),分別測定MaflbA、MaflbC、Maste12、MabrlA、MafluG、MafadA和MawetA敲除突變菌株中其它產(chǎn)孢調(diào)控基因的表達水平,確定兩條調(diào)控途徑:由fluG-flbs產(chǎn)孢調(diào)控途徑和Fad A(Gα)產(chǎn)孢調(diào)控途徑共同調(diào)控產(chǎn)孢,brlA處于調(diào)控途徑的關(guān)鍵位置,flbB和flbC雙向調(diào)控產(chǎn)孢;4.蝗綠僵菌MabrlA調(diào)控孢子細胞壁主要成分的含量和分布,從而影響其抗逆特性。熒光染料染色總甘露聚糖,發(fā)現(xiàn)ΔMabrlA菌株孢子表面暴露出來的總甘露糖的熒光強度弱于WT,ΔMabrlA菌株孢子表面暴露出來的殼聚糖的熒光強度弱于WT,ΔMabrlA菌株的β-1,3-葡聚糖熒光強度與WT無差異;ΔMabrlA菌株菌絲表面暴露出來的殼聚糖分布不均勻。提取細胞壁組成分析,ΔMabrlA菌株的幾丁質(zhì)含量是野生型的三倍,甘露糖蛋白是野生型菌株的30%,而葡聚糖含量與野生型相差不大。5.蝗綠僵菌MabrlA缺失導致東亞飛蝗體液免疫、細胞免疫反應增強,是其毒力喪失的重要機制。經(jīng)ΔMabrlA菌株處理的蝗蟲不死亡,ΔMabrlA菌株的附著胞形成率顯著少于WT、附著胞的膨壓降低。附著胞穿透體表過程中,ΔMabrlA菌株的水解蛋白酶Pr1和Chi上調(diào)表達;ΔMabrlA菌株在蝗蟲體內(nèi)不生長;ΔMabrlA菌株的黑化作用加強、酚氧化酶活性提高;血細胞和脂肪體中TOLL通路免疫信號基因Lmspatzle、Lmcactus上調(diào)表達,增強寄主的免疫,抵抗真菌的侵染。在蝗綠僵菌中的作用,特別是MabrlA對蝗綠僵菌細胞壁成分的含量和分布的影響,進一步影響蝗綠僵菌的抗逆特性和侵染致病能力,研究昆蟲病原真菌產(chǎn)孢調(diào)控機制和侵染致病的分子機制,對充分挖掘其在生物防治中的潛力,具有十分重要的理論意義和實際應用價值。
【關(guān)鍵詞】：蝗綠僵菌 C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 基因敲除 產(chǎn)孢 侵染致病能力
【學位授予單位】：重慶大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S476.1
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-9
• 1 緒論9-16
• 1.1 引言9
• 1.2 研究背景9-13
• 1.2.1 昆蟲病原真菌產(chǎn)孢研究進展9-10
• 1.2.2 昆蟲病原真菌的致病機制10-12
• 1.2.3 絲狀真菌產(chǎn)孢分子研究進展12-13
• 1.3 立題依據(jù)及研究目的13-14
• 1.4 研究內(nèi)容14
• 1.5 實驗技術(shù)路線14-15
• 1.6 本項目的特色與創(chuàng)新之處15-16
• 2 蝗綠僵菌MabrlA的功能分析16-62
• 2.1 主要材料16-20
• 2.1.1 供試菌株和昆蟲16
• 2.1.2 質(zhì)粒載體16
• 2.1.3 主要培養(yǎng)基、實驗溶液16-18
• 2.1.4 主要試劑18-19
• 2.1.5 主要設(shè)備19-20
• 2.2 主要方法20-35
• 2.2.1 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞20
• 2.2.2 根癌農(nóng)桿菌AGL-1 感受態(tài)細胞的制備及電轉(zhuǎn)化20-21
• 2.2.3 農(nóng)桿菌介導的蝗綠僵菌的轉(zhuǎn)化21-22
• 2.2.4 微量提取真菌的基因組22
• 2.2.5 基因全長比對及cDNA ORF全長克隆22-23
• 2.2.6 MabrlA基因的生物信息學分析23-24
• 2.2.7 MabrlA基因的敲除、回復表達載體構(gòu)建24-26
• 2.2.8 敲除菌株、回復菌株的初步篩選驗證26-27
• 2.2.9 Southern blot驗證MabrlA敲除、回復菌株27-29
• 2.2.10 MabrlA對蝗綠僵菌生長與產(chǎn)孢的影響29-30
• 2.2.11 MabrlA對蝗綠僵菌孢子特性的影響30
• 2.2.12 MabrlA對蝗綠僵菌孢子細胞壁的影響30-33
• 2.2.13 MabrlA調(diào)控蝗綠僵菌產(chǎn)孢的途徑33
• 2.2.14 毒力實驗分析33-35
• 2.3 實驗結(jié)果與分析35-58
• 2.3.1 生物信息學分析MabrlA基因35-37
• 2.3.2 MabrlA重組載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化菌株驗證37
• 2.3.3 MabrlA對蝗綠僵菌生長與產(chǎn)孢的影響37-41
• 2.3.4 MabrlA對蝗綠僵菌孢子特性的影響41-44
• 2.3.5 MabrlA對蝗綠僵菌孢子細胞壁的影響44-48
• 2.3.6. MabrlA調(diào)控蝗綠僵菌產(chǎn)孢的途徑48-51
• 2.3.7 MabrlA對蝗綠僵菌致病性的影響51-58
• 2.4 討論58-62
• 3 主要結(jié)論和后續(xù)工作建議62-64
• 3.1 主要研究結(jié)論62
• 3.2 后續(xù)試驗建議62-64
• 致謝64-66
• 參考文獻66-74
• 附錄74-75
• A 作者在攻讀碩士學位期間發(fā)表論文的目錄74-75
• B 序列75

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