本文關(guān)鍵詞：木霉素合成基因簇（tri）的克隆與tri3、tri11、tri4基因功能研究

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【摘要】：木霉素(Trichodermin)是單端孢霉烯類化合物的一種,主要是由臍孢木霉菌(Trichoderma brevicompactum)產(chǎn)生,對(duì)多種植物病原真菌具有較強(qiáng)的抑制作用。為研究臍孢木霉菌tri基因簇中各基因與木霉素合成的關(guān)系,本研究以臍孢木霉菌0248為實(shí)驗(yàn)材料,進(jìn)行了三個(gè)方面的研究,主要結(jié)果及結(jié)論如下:(1)克隆得到臍孢木霉菌0248的tri基因簇,全長(zhǎng)24793 bp,其中包含7個(gè)與鐮刀菌TRI基因同源的開(kāi)放閱讀框,經(jīng)鑒定這7個(gè)開(kāi)放閱讀框依次為tri6、tri4、tri3、tri10、tri11、tri12、tri14基因,但是與TRI5基因同源的tri5基因并不在基因簇內(nèi)。0248中的tri基因與已報(bào)道的臍孢木霉菌IBT 40841和葦狀木霉(T.arundinaceum)IBT 40837中相對(duì)應(yīng)的基因具有較高的同源性,三株菌中tri基因編碼的蛋白同源性都在90%以上,但I(xiàn)BT 40841、IBT 40837和0248在tri11與tri12基因之間的間隔長(zhǎng)度上存在明顯差異。(2)利用q PCR分析基因簇中各基因在三種不同產(chǎn)素水平下的表達(dá)差異,結(jié)果顯示:高產(chǎn)素培養(yǎng)基中,培養(yǎng)40 h時(shí)tri基因表達(dá)量遠(yuǎn)高于其在低產(chǎn)或不產(chǎn)素培養(yǎng)基中基因表達(dá)量,即tri基因簇中基因表達(dá)量與木霉素的產(chǎn)量呈正相關(guān)。(3)分別構(gòu)建了tri3、tri11、tri4基因的敲除載體pKT3、pKT11、pKT4,以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的同源重組策略分別敲除tri3、tri11、tri4基因,篩選得到三個(gè)不同基因的缺失株,并分別命名為△tri3、△tri11、△tri4�！鱰ri3轉(zhuǎn)化株發(fā)酵液中木霉素含量大幅降低,根據(jù)木霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及tri3基因同源性分析得出:tri3基因編碼的蛋白功能是催化木霉醇的骨架C-4位置羥基的乙�；�。tri3基因的敲除對(duì)tri基因簇轉(zhuǎn)錄水平影響的研究表明:tri3基因敲除后對(duì)基因簇中的基因表達(dá)起到了反饋調(diào)節(jié)的作用。tri3基因敲除后,木霉素仍有少量產(chǎn)生,推測(cè)是由于菌內(nèi)存在的乙酰轉(zhuǎn)移酶同工酶在起作用。tri11基因敲除后,發(fā)酵液中木霉素的含量為零,據(jù)此我們得出tri11基因直接參與木霉素的合成,基因序列分析顯示tri11基因含有P450單加氧酶家族的保守結(jié)構(gòu),推測(cè)tri11基因編碼的蛋白功能為:催化EPT(12,13-epoxytrichothec-9-ene)骨架上C-4位置上的羥基化。△tri4轉(zhuǎn)化株發(fā)酵液中木霉素含量為零,據(jù)此可以確定tri4基因直接參與木霉素的合成。根據(jù)葦狀木霉菌中tri4基因功能推測(cè)tri4基因編碼細(xì)胞色素P450單加氧酶,其功能是催化單端孢霉二烯發(fā)生3步氧化反應(yīng),生成異單端孢霉二醇。
【關(guān)鍵詞】：臍孢木霉菌 木霉素 tri基因簇 基因敲除
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)計(jì)量大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S476.1
【目錄】：

• 致謝6-8
• 摘要8-10
• Abstract10-17
• 1 緒論17-28
• 1.1 木霉菌的研究概況17-18
• 1.2 木霉菌的的生防作用及生防機(jī)制18
• 1.3 單端孢霉烯類化合物的主要性質(zhì)18-23
• 1.3.1 單端孢霉烯類化合物的分類18-19
• 1.3.2 木霉素簡(jiǎn)介及其生防作用19-20
• 1.3.3 單端孢霉烯類化合物的合成途徑20-23
• 1.4 真菌基因敲除研究進(jìn)展23-26
• 1.4.1 基因敲除載體構(gòu)建方法24-25
• 1.4.2 基因敲除載體的轉(zhuǎn)化體系25-26
• 1.5 研究?jī)?nèi)容及意義26-28
• 1.5.1 研究的主要內(nèi)容26-27
• 1.5.2 研究的重要意義27-28
• 2 臍孢木霉菌0248中tri基因簇的克隆與序列分析28-44
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器28-29
• 2.1.1 菌株及質(zhì)粒28
• 2.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑28
• 2.1.3 試劑盒、酶及耗材28-29
• 2.1.4 主要儀器29
• 2.2 方法29-34
• 2.2.1 臍孢木霉菌0248的保藏與培養(yǎng)29-30
• 2.2.2 臍孢木霉菌0248中總DNA的提取30
• 2.2.3 臍孢木霉菌0248中總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄30-31
• 2.2.4 臍孢木霉菌0248中tri基因簇的克隆31-33
• 2.2.5 基因簇的拼接及序列分析33-34
• 2.3 tri基因在不同碳源培養(yǎng)下的差異表達(dá)分析34-35
• 2.3.1 不同碳源培養(yǎng)下總cDNA的獲取34
• 2.3.2 不同碳源培養(yǎng)下tri基因表達(dá)量分析34-35
• 2.3.3 不同碳源培養(yǎng)下木霉素產(chǎn)素水平分析35
• 2.4 結(jié)果與分析35-41
• 2.4.1 基因簇全長(zhǎng)與序列分析35-36
• 2.4.2 基因簇的同源性分析36-38
• 2.4.3 不同產(chǎn)素水平下基因表達(dá)量的分析38-41
• 2.4.4 木霉素產(chǎn)量分析41
• 2.5 討論41-44
• 2.5.1 0248與葦狀木霉菌tri基因簇之間有較高同源性41-42
• 2.5.2 0248中木霉素產(chǎn)量與tri基因表達(dá)量呈正相關(guān)42-44
• 3 臍孢木霉菌0248中tri3、tri11、tri4基因的分析與敲除44-63
• 3.1 材料44-46
• 3.1.1 菌株及質(zhì)粒44
• 3.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑44-45
• 3.1.3 試劑盒、酶及耗材45
• 3.1.4 儀器設(shè)備45-46
• 3.2 臍孢木霉菌0248中tri3、tri11、tri4基因序列分析46
• 3.3 基因敲除載體的構(gòu)建46-50
• 3.3.1 基因敲除同源重組片段的構(gòu)建46-49
• 3.3.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建49-50
• 3.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化敲除tri3、tri11、tri4基因50-53
• 3.4.1 農(nóng)桿菌感受態(tài)制備50-51
• 3.4.2 重組載體pKT3、pKT11、pKT4轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌51
• 3.4.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)tri3、tri11、tri4基因敲除片段轉(zhuǎn)化0248基因組51-52
• 3.4.4 tri3、tri11和tri4基因敲除突變體的驗(yàn)證52-53
• 3.5 結(jié)果53-61
• 3.5.1 臍孢木霉菌0248中tri3、tri11、tri4基因序列分析53-58
• 3.5.2 tri3、tri11和tri4基因敲除載體的構(gòu)建58-59
• 3.5.3 從基因組水平驗(yàn)證tri3、tri11和tri4基因敲除轉(zhuǎn)化株59-61
• 3.6 討論61-63
• 3.6.1 融合PCR技術(shù)構(gòu)建載體61-62
• 3.6.2 無(wú)啟動(dòng)子終止子的潮霉素抗性基因有助于提高陽(yáng)性克隆比例62-63
• 4 臍孢木霉菌0248中tri3、tri11、tri4基因功能分析63-74
• 4.1 材料63
• 4.1.1 菌株及質(zhì)粒63
• 4.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑63
• 4.1.3 試劑盒、酶及耗材63
• 4.1.4 主要儀器63
• 4.2 方法63-64
• 4.2.1 tri3、tri11和tri4基因敲除轉(zhuǎn)化株的遺傳穩(wěn)定性分析63-64
• 4.2.2 tri3、tri11和tri4基因敲除轉(zhuǎn)化株中基因表達(dá)量分析64
• 4.2.3 tri3、tri11和tri4基因敲除轉(zhuǎn)化株中木霉素產(chǎn)量分析64
• 4.3 結(jié)果64-71
• 4.3.1 tri3、tri11和tri4基因敲除轉(zhuǎn)化株具有遺傳穩(wěn)定性64-65
• 4.3.2 tri3、tri11和tri4基因缺失影響tri基因的轉(zhuǎn)錄水平65-69
• 4.3.3 tri3、tri11和tri4基因敲除對(duì)木霉素產(chǎn)量的影響69-71
• 4.4 討論71-74
• 4.4.1 tri3基因編碼蛋白催化木霉醇C-4位置羥基乙�；�71
• 4.4.2 tri11基因編碼蛋白催化EPT骨架上C-4位置的羥基化71-72
• 4.4.3 tri4基因編碼蛋白直接參與木霉素的合成72-74
• 5 總結(jié)與展望74-76
• 5.1 全文總結(jié)74-75
• 5.2 展望75-76
• 參考文獻(xiàn)76-84
• 作者簡(jiǎn)介84

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 袁小楓;木霉素合成基因簇（tri）的克隆與tri3、tri11、tri4基因功能研究[D];中國(guó)計(jì)量大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：748171