發(fā)布時(shí)間：2017-08-25 10:22

  本文關(guān)鍵詞：姜黃素對(duì)朱砂葉螨幾丁質(zhì)酶活性及基因表達(dá)的影響

  更多相關(guān)文章： 姜黃素 朱砂葉螨 幾丁質(zhì)酶 酶活性 基因表達(dá)

【摘要】：朱砂葉螨(Tetranychus cinnabarinus)可危害多種作物,是最重要的世界性經(jīng)濟(jì)害螨之一。該螨具有世代周期短、繁殖能力強(qiáng)等生物學(xué)特性,這種螨的特性加上長期以來化學(xué)殺螨劑的大量使用,使“3R”問題日益嚴(yán)重,因此迫切需要開發(fā)尋找高效低毒的新型螨類控制劑。植物源殺螨活性物質(zhì),易溶于水,對(duì)非標(biāo)靶生物低毒,無殘留,還可通過非目標(biāo)生物體生物降解,因此,這些化合物成為新型螨類控制劑的重要選擇對(duì)象之一。姜黃素(curcumin)主要提取于中藥植物姜黃(Curcuma longa),研究發(fā)現(xiàn),其對(duì)朱砂葉螨表現(xiàn)出較強(qiáng)的生物活性。天然產(chǎn)物農(nóng)藥研究室為驗(yàn)證姜黃素的殺螨活性,進(jìn)行了大量的生物活性測定實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)經(jīng)姜黃素處理后,螨出現(xiàn)大量失水、體表皺縮等死亡癥狀,這些癥狀表現(xiàn)說明姜黃素可能作用于螨的體壁結(jié)構(gòu)。幾丁質(zhì)是螨體壁的主要組成成分,其合成和降解在螨的生長發(fā)育過程中有至關(guān)重要的作用。但是目前對(duì)姜黃素的致死機(jī)制研究多集中在解毒酶系活性的變化,而其對(duì)幾丁質(zhì)的合成和降解酶系的影響尚未研究報(bào)道。本研究以幾丁質(zhì)酶為切入點(diǎn),從生理生化及分子水平兩個(gè)方面研究了姜黃素處理下朱砂葉螨幾丁質(zhì)酶的變化,從而推測對(duì)幾丁質(zhì)降解的影響,以期為探明姜黃素對(duì)朱砂葉螨的作用機(jī)制提供依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1.測定了姜黃素對(duì)朱砂葉螨雌成螨的觸殺毒力,得到了各亞致死劑量利用玻片浸漬法測得姜黃素處理朱砂葉螨48 h后的毒力回歸方程為y=-0.474+1.234x,LC50為2.424 mg/mL,95%的置信區(qū)間為1.715~3.733 mg/mL。48 h后的亞致死劑量即LC40、LC30、LC20、LC10分別為1.511、0.911、0.504和0.222 mg/mL。測定了各亞致死劑量姜黃素處理下對(duì)朱砂葉螨發(fā)育歷期的影響。結(jié)果表明,朱砂葉螨卵期、幼螨期、若螨期和成螨期與對(duì)照相比總體上呈縮短的趨勢,并無顯著差異,但是雌成螨的平均壽命顯著縮短。2.明確了朱砂葉螨幾丁質(zhì)酶的基本酶學(xué)性質(zhì)利用改良的schales法,研究了朱砂葉螨幾丁質(zhì)酶的基本酶學(xué)性質(zhì),包括最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性、最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性、金屬離子對(duì)酶活性的影響和動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km值。朱砂葉螨幾丁質(zhì)酶的最適反應(yīng)溫度約為35℃,對(duì)高溫比較敏感;最適反應(yīng)pH約為7.0,在pH值為6.0時(shí)最穩(wěn)定;金屬離子對(duì)幾丁質(zhì)酶活性存在影響,大部分的金屬離子對(duì)酶有較強(qiáng)的抑制作用,但也有少數(shù)的金屬離子對(duì)酶有激活作用;水解膠狀幾丁質(zhì)的Km值為5.15μmol/L。這些研究結(jié)果進(jìn)一步豐富了螨類相關(guān)幾丁質(zhì)酶生物學(xué)特性研究,可為基于幾丁質(zhì)酶的殺螨劑篩選奠定理論基礎(chǔ)。在測定了朱砂葉螨幾丁質(zhì)酶酶學(xué)性質(zhì)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步測定了螨不同發(fā)育階段酶活性的情況。分析結(jié)果表明,卵期酶比活力最低,若螨期酶比活力最高,且卵期和若螨期具有顯著性差異。這可能因?yàn)橛昨腿趄谑球懫ぐl(fā)育的階段,急需幾丁質(zhì)酶發(fā)揮作用,促進(jìn)幾丁質(zhì)的降解。用不同濃度姜黃素處理朱砂葉螨雌成螨24 h后,隨著濃度的升高幾丁質(zhì)酶比活力不斷降低,在2.0和4.0 mg/mL時(shí)與對(duì)照相比已存在顯著差異,特別在4.0 mg/mL,對(duì)幾丁質(zhì)酶的抑制率達(dá)到了約32%。由此推測,姜黃素的殺螨作用機(jī)制可能與幾丁質(zhì)酶有關(guān)。3.克隆并分析了6條朱砂葉螨幾丁質(zhì)酶基因(chitinase,TcCHTs)的cDNA序列參考朱砂葉螨近緣種二斑葉螨(Tetranychus urticae)的全基因組信息,利用RT-PCR技術(shù),克隆獲得了6條TcCHTs的cDNA序列。這6條基因分別命名為TcCHIT1、TcCHIT2、TcCHIT3、TcCHT4、TcCHT5和TcCHT6,GenBank登錄號(hào)分別為KT956964、KT956965、KT956966、KT956967、KT956968和KT9569692。6條幾丁質(zhì)酶基因的結(jié)構(gòu)域存在差異:其中TcCHIT1、TcCHIT2、TcCHIT3和TcCHT4推導(dǎo)的氨基酸序列含有一個(gè)信號(hào)肽、一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域和一個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)域,而TcCHT5和TcCHT6由跨膜域代替了信號(hào)肽。預(yù)測蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分別為60.80、69.03、104.32、59.75、45.63和49.05 kDa,等電點(diǎn)分別為5.44、8.65、6.23、6.07、6.12和8.27。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果顯示這6條基因與各自相對(duì)應(yīng)的二斑葉螨基因聚在同一支上。4.測定了朱砂葉螨TcCHTs基因在不同發(fā)育階段及姜黃素處理后表達(dá)量的差異在完成了對(duì)6條TcCHTs克隆與分析的基礎(chǔ)上,利用RT-qPCR測定了其在朱砂葉螨不同發(fā)育階段的表達(dá)量。結(jié)果顯示,幼螨和若螨期的基因表達(dá)量顯著高于卵期和成螨期,其中TcCHIT1、TcCHIT2、TcCHIT3和TcCHT4 4條基因的這種差異更加明顯,前者甚至高出后者近百倍。用不同濃度姜黃素處理朱砂葉螨若螨24 h后,6條基因的表達(dá)量均有不同程度的降低,其中TcCHIT1和TcCHT5的下降程度更加顯著。
【關(guān)鍵詞】：姜黃素 朱砂葉螨 幾丁質(zhì)酶 酶活性 基因表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S433.7
【目錄】：

• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-23
• 1 姜黃素的生物活性多樣性研究13-15
• 1.1 姜黃素的藥理活性研究現(xiàn)狀13-14
• 1.2 姜黃素的殺蟲抑菌活性研究現(xiàn)狀14
• 1.3 姜黃素的殺螨活性研究現(xiàn)狀14-15
• 2 植物源殺螨劑的研究現(xiàn)狀15-16
• 3 幾丁質(zhì)酶及其抑制劑的研究16-20
• 3.1 微生物幾丁質(zhì)酶17
• 3.2 植物幾丁質(zhì)酶17
• 3.3 昆蟲幾丁質(zhì)酶17-20
• 4 論文選題依據(jù)及研究內(nèi)容20-23
• 4.1 選題依據(jù)20
• 4.2 研究內(nèi)容20-23
• 第二章 姜黃素對(duì)朱砂葉螨的毒力及對(duì)發(fā)育歷期的影響23-29
• 第一節(jié) 姜黃素對(duì)朱砂葉螨的毒力測定23-25
• 1 材料與方法23-24
• 1.1 供試螨類23
• 1.2 供試藥劑23-24
• 1.3 生物活性測定方法24
• 1.4 數(shù)據(jù)分析24
• 2 結(jié)果與分析24-25
• 2.1 姜黃素對(duì)朱砂葉螨雌成螨的觸殺毒力24
• 2.2 姜黃素對(duì)朱砂葉螨實(shí)驗(yàn)種群的亞致死劑量24-25
• 3 小結(jié)與討論25
• 第二節(jié) 亞致死劑量姜黃素處理朱砂葉螨卵后發(fā)育歷期比較25-29
• 1 材料與方法26
• 1.1 供試螨類26
• 1.2 供試藥劑26
• 1.3 試驗(yàn)方法26
• 1.4 數(shù)據(jù)分析26
• 2 結(jié)果與分析26-27
• 3 小結(jié)與討論27-29
• 第三章 姜黃素對(duì)朱砂葉螨幾丁質(zhì)酶活性的影響29-41
• 第一節(jié) 朱砂葉螨幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)29-36
• 1 材料與方法29-32
• 1.1 供試螨類29
• 1.2 主要試劑和儀器29-30
• 1.3 試劑配制30
• 1.4 酶源制備30
• 1.5 酶源蛋白含量測定30-31
• 1.6 幾丁質(zhì)酶活性測定31
• 1.7 朱砂葉螨幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)測定31-32
• 2 結(jié)果與分析32-35
• 2.1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線及N-乙酰-D-氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作32-33
• 2.2 幾丁質(zhì)酶最適溫度及熱穩(wěn)定性33
• 2.3 幾丁質(zhì)酶最適反應(yīng)pH值及pH穩(wěn)定性33-34
• 2.4 金屬離子對(duì)酶活性的影響34
• 2.5 動(dòng)力學(xué)常數(shù)K_m的測定34-35
• 3 小結(jié)與討論35-36
• 第二節(jié) 朱砂葉螨幾丁質(zhì)酶在不同發(fā)育階段及姜黃素處理后活性差異36-41
• 1 材料與方法36-37
• 1.1 供試螨類36
• 1.2 主要試劑和儀器36
• 1.3 試劑配制36
• 1.4 酶源制備36
• 1.5 酶源蛋白含量測定36-37
• 1.6 幾丁質(zhì)酶活性測定37
• 1.7 數(shù)據(jù)分析37
• 2 結(jié)果與分析37-38
• 2.1 朱砂葉螨不同發(fā)育階段幾丁質(zhì)酶活性比較37
• 2.2 姜黃素對(duì)朱砂葉螨雌成螨幾丁質(zhì)酶活性的影響37-38
• 3 小結(jié)與討論38-41
• 第四章 姜黃素對(duì)朱砂葉螨幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)的影響41-61
• 第一節(jié) 朱砂葉螨幾丁質(zhì)酶基因克隆及序列分析41-54
• 1 材料與方法41-46
• 1.1 供試螨類41
• 1.2 主要試劑和儀器41-42
• 1.3 試劑配制42
• 1.4 總RNA的提取42-43
• 1.5 第一鏈cDNA的合成43-44
• 1.6 引物設(shè)計(jì)44
• 1.7 PCR反應(yīng)44-45
• 1.8 PCR產(chǎn)物克隆和測序45
• 1.9 基因序列生物信息學(xué)分析45-46
• 2 結(jié)果與分析46-54
• 2.1 朱砂葉螨總RNA的提取46
• 2.2 朱砂葉螨TcCHTs基因擴(kuò)增結(jié)果46-47
• 2.3 朱砂葉螨TcCHTs基因序列生物信息學(xué)分析47
• 2.4 朱砂葉螨TcCHTs基因同源性分析47-54
• 3 小結(jié)與討論54
• 第二節(jié) 朱砂葉螨TcCHTs基因在不同發(fā)育階段及姜黃素處理后表達(dá)模式分析54-61
• 1 材料與方法55-57
• 1.1 供試螨類55
• 1.2 主要試劑和儀器55
• 1.3 總RNA的提取55
• 1.4 第一鏈cDNA的合成55
• 1.5 引物設(shè)計(jì)55-56
• 1.6 溶解曲線分析56
• 1.7 定量PCR56-57
• 1.8 數(shù)據(jù)分析57
• 2 結(jié)果與分析57-60
• 2.1 引物擴(kuò)增效率57
• 2.2 朱砂葉螨不同發(fā)育階段幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)模式57-59
• 2.3 不同濃度姜黃素對(duì)朱砂葉螨幾丁質(zhì)酶基因mRNA表達(dá)的影響59-60
• 3 小結(jié)與討論60-61
• 第五章 結(jié)論與展望61-63
• 1 主要結(jié)論61-62
• 2 展望62-63
• 參考文獻(xiàn)(References)63-71
• 致謝71-73
• 在讀期間發(fā)表論文73

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