本文關(guān)鍵詞：青枯菌copSRABCD抗銅基因簇的功能研究

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【摘要】：由茄科雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum,簡(jiǎn)稱(chēng)青枯菌)引起的植物細(xì)菌性青枯病廣泛分布于熱帶、亞熱帶、溫帶甚至高緯度地區(qū),對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)構(gòu)成了巨大威脅。由于青枯菌地域分布遼闊、寄主范圍廣泛、種內(nèi)遺傳結(jié)構(gòu)復(fù)雜、且栽培寄主缺乏抗源,因此被公認(rèn)為世界性重大病害。在我國(guó),青枯病的防治主要依賴(lài)于使用銅制劑和農(nóng)用鏈霉素進(jìn)行灌根處理,銅制劑的泛濫使用導(dǎo)致土壤的重金屬污染日益加重,并且植物病原細(xì)菌的抗銅菌株也接連被發(fā)現(xiàn)。迄今為止,尚未見(jiàn)青枯菌銅抗性及其分子機(jī)理相關(guān)領(lǐng)域的研究報(bào)道。本研究基于青枯菌Po82菌株的全基因組序列信息,以位于其大質(zhì)粒上可能的銅抗性編碼基因簇—copSRABCD為研究對(duì)象,采用單個(gè)基因和整體敲除策略,以期明確該基因簇及單個(gè)基因與青枯菌銅抗性、致病性等表型生物學(xué)特征之間的關(guān)系;本研究對(duì)闡明青枯菌銅脅迫應(yīng)答的分子機(jī)制、治理重金屬污染土壤、微生物冶金、指導(dǎo)田間用藥等均有重要意義。1.銅抗性表型差異鑒定及copSRABCD基因簇的群體分布檢測(cè)copSRABCD銅抗性基因簇在青枯菌群體中的分布驗(yàn)證結(jié)果顯示:copSRABCD抗銅基因簇廣泛分布于參試小樣本的青枯菌群體中;但供試菌株銅抗性水平的測(cè)定結(jié)果卻顯示青枯菌的不同小種之間銅抗性表型存在著明顯的差異。2.突變株及其相應(yīng)互補(bǔ)菌株的構(gòu)建基于青枯菌Po82菌株的全基因組序列信息,以位于其大質(zhì)粒上可能的銅抗性編碼基因簇copABCD為研究對(duì)象,采用單個(gè)基因和整體敲除策略,分別構(gòu)建Po82菌株copABCD基因簇、基因簇內(nèi)單個(gè)候選基因copB、copC的缺失突變株及其相應(yīng)互補(bǔ)菌株。3.copABCD基因簇及單一候選基因功能驗(yàn)證突變株ΔcopABCD、ΔcopB、ΔcopC對(duì)青枯菌的致病性、運(yùn)動(dòng)性以及在銅逆境下的生長(zhǎng)速率都具有一定的生物學(xué)功能,會(huì)導(dǎo)致青枯菌的致病能力減弱,運(yùn)動(dòng)性降低,在銅逆境的條件下生長(zhǎng)速率減緩。4.常用的含銅殺菌劑及無(wú)銅殺菌劑對(duì)青枯菌4號(hào)小種抑菌活性的測(cè)定。通過(guò)對(duì)7種常用殺菌劑室內(nèi)毒力試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)中生菌素和氨基寡糖素在試驗(yàn)中表現(xiàn)出相當(dāng)強(qiáng)的離體抑菌效果,遠(yuǎn)高于常用的含銅殺菌劑,且復(fù)配之后表現(xiàn)為增效效果,對(duì)于田間防治青枯病有良好的指導(dǎo)意義。
【關(guān)鍵詞】：青枯菌 銅抗性 copSRABCD基因簇 致病力
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S432.42
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-13
• 第一章 引言13-26
• 1.1 青枯菌的危害及分類(lèi)13-17
• 1.1.1 青枯菌及其引起的病害13
• 1.1.2 青枯菌的病害循環(huán)13-14
• 1.1.3 青枯菌傳統(tǒng)分類(lèi)方法14-15
• 1.1.4 青枯菌的演化型分類(lèi)框架15-16
• 1.1.5 青枯菌發(fā)病癥狀及防治方法16-17
• 1.2 細(xì)菌與銅抗性17-24
• 1.2.1 銅的生理作用及毒性17
• 1.2.2 含銅殺菌劑的發(fā)展歷程17
• 1.2.3 含銅殺菌劑的基本分類(lèi)17-18
• 1.2.4 植物細(xì)菌病害的銅防治18-19
• 1.2.5 銅與重金屬污染19
• 1.2.6 銅抗性菌株的發(fā)現(xiàn)19-20
• 1.2.7 細(xì)菌銅抗性分子機(jī)理20-22
• 1.2.8 細(xì)菌抗銅性與致病性的關(guān)系22
• 1.2.9 細(xì)菌銅抗性的應(yīng)用22
• 1.2.10 青枯菌銅抗性研究現(xiàn)狀22-24
• 1.3.本論文研究的目的意義和技術(shù)路線(xiàn)24-26
• 1.3.1 研究的目的和意義24
• 1.3.2 研究切入點(diǎn)24-25
• 1.3.3 技術(shù)路線(xiàn)圖25-26
• 第二章 青枯菌群體的銅抗性表型差異與cop抗銅基因簇的群體分布26-36
• 2.1 試驗(yàn)材料26
• 2.1.1 主要試劑26
• 2.1.2 試驗(yàn)用菌株及相關(guān)培養(yǎng)基26
• 2.2 試驗(yàn)方法26-28
• 2.2.1 青枯菌銅抗性表型差異測(cè)定26-27
• 2.2.2 cop銅抗性基因簇在青枯菌群體中的分布檢測(cè)27-28
• 2.3 試驗(yàn)結(jié)果28-34
• 2.3.1 供試菌株銅抗性水平測(cè)定結(jié)果28-32
• 2.3.2 cop銅抗性基因簇在青枯菌群體中的分布檢測(cè)結(jié)果32-34
• 2.4 分析與討論34-36
• 第三章 青枯菌copB、copC單基因生物學(xué)功能探索36-50
• 3.1 試驗(yàn)材料36-38
• 3.1.1 試驗(yàn)所用菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)條件36
• 3.1.2 供試培養(yǎng)基36-38
• 3.1.3 所用實(shí)驗(yàn)儀器及試劑38
• 3.2 試驗(yàn)方法38-44
• 3.2.1 copB、copC基因敲除載體的構(gòu)建38-41
• 3.2.2 copB、copC基因缺失菌株的構(gòu)建41-42
• 3.2.3 copB、copC基因互補(bǔ)菌株的構(gòu)建42-43
• 3.2.4 copB、copC基因缺失對(duì)青枯菌致病力影響的測(cè)定43-44
• 3.2.5 copB、copC基因基礎(chǔ)生物學(xué)測(cè)定44
• 3.3 試驗(yàn)結(jié)果44-49
• 3.3.1 基因缺失菌株和互補(bǔ)菌株的篩選與鑒定44-45
• 3.3.2 copB、copC單基因缺失對(duì)青枯菌致病力的影響45-46
• 3.3.3 copB、copC單基因基礎(chǔ)生物學(xué)測(cè)定結(jié)果46-49
• 3.4 分析與討論49-50
• 第四章 青枯菌copABCD基因簇生物學(xué)功能探索50-61
• 4.1 試驗(yàn)材料50-51
• 4.1.1 試驗(yàn)所用菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)條件50
• 4.1.2 供試培養(yǎng)基50
• 4.1.3 所用實(shí)驗(yàn)儀器及試劑50-51
• 4.2 試驗(yàn)方法51-56
• 4.2.1 copABCD基因簇敲除載體的構(gòu)建51-53
• 4.2.2 copABCD基因簇的基因缺失菌株的構(gòu)建53
• 4.2.3 copABCD基因簇的互補(bǔ)菌株的構(gòu)建53-54
• 4.2.4 copABCD基因簇缺失對(duì)青枯菌致病力影響的測(cè)定54
• 4.2.5 copABCD基因簇的基礎(chǔ)生物學(xué)測(cè)定54-55
• 4.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)copABCD基因簇相關(guān)單基因的表達(dá)55-56
• 4.3 試驗(yàn)結(jié)果56-60
• 4.3.1 copABCD基因簇缺失突變株和互補(bǔ)菌株的篩選與鑒定56-57
• 4.3.2 copABCD基因簇缺失對(duì)青枯菌致病力的影響57
• 4.3.3 copABCD基因簇的基礎(chǔ)生物學(xué)測(cè)定結(jié)果57-59
• 4.3.4 copABCD基因簇相關(guān)單基因的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果59-60
• 4.4 分析與討論60-61
• 第五章 七種殺菌劑對(duì)青枯菌4號(hào)小種Z-AQ-2 的抑菌活性測(cè)定研究61-69
• 5.1 試驗(yàn)材料61
• 5.1.1 供試殺菌劑61
• 5.1.2 供試培養(yǎng)基及菌株61
• 5.2 試驗(yàn)方法61-63
• 5.2.1 供試菌株的分離及PCR驗(yàn)證61
• 5.2.2 供試藥劑毒力測(cè)定61-62
• 5.2.3 Colby法評(píng)價(jià)藥劑混用效果62-63
• 5.2.4 數(shù)據(jù)分析63
• 5.3 殺菌劑毒力測(cè)定結(jié)果63-64
• 5.3.1 不含銅殺菌劑之間抑菌活性比較63
• 5.3.2 含銅殺菌劑之間抑菌活性比較63
• 5.3.3 含銅與不含銅的殺菌劑之間的抑菌活性比較63-64
• 5.4 Colby法對(duì)葉枯唑和氫氧化銅、葉枯唑和中生菌素以及中生菌素和氨基寡糖素的混用效果評(píng)價(jià)64-68
• 5.4.1 葉枯唑與中生菌素混用組合對(duì)青枯菌的抑菌效果64-65
• 5.4.2 葉枯唑與氫氧化銅混用組合對(duì)青枯菌的抑制效果65-66
• 5.4.3 氨基寡糖素與中生菌素混用組合對(duì)青枯菌的抑菌效果66-67
• 5.4.4 7種殺菌劑實(shí)驗(yàn)室用量與田間用量比對(duì)結(jié)果67-68
• 5.5 結(jié)論和討論68-69
• 第六章 全文結(jié)論69-70
• 后續(xù)工作展望70-71
• 參考文獻(xiàn)71-77
• 致謝77-78
• 作者簡(jiǎn)歷78

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6 張麗R

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