本文關(guān)鍵詞：核盤菌蛋白激發(fā)子同源物SsPemG1的功能分析

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【摘要】：核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)是一種廣泛分布的產(chǎn)菌核的死體營養(yǎng)型真菌,嚴重威脅著油菜生產(chǎn)安全,造成巨大經(jīng)濟損失。由于傳統(tǒng)防治手段弊端凸顯,從基因水平研究核盤菌致病機理,尋找新一代環(huán)保、高效的微生物農(nóng)藥刻不容緩。隨著核盤菌全基因組測序完成,核盤菌DNA轉(zhuǎn)化體系以及RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)的逐漸成熟,為開展核盤菌功能基因的研究提供便利。植物在長期進化過程中形成了復(fù)雜的防衛(wèi)反應(yīng)以應(yīng)對病原微生物的入侵,而蛋白激發(fā)子可以刺激植物快速形成程序性細胞死亡(Programmed Cell Death,PCD)阻止病原菌的進一步擴散。因此開展蛋白激發(fā)子的研究對于挖掘新型安全、高效的微生物農(nóng)藥意義重大。PemG1(GenBank accession number:EF062504)是一個分離自稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)的蛋白激發(fā)子,對誘導(dǎo)水稻抵御稻瘟病菌的侵染有較好作用。本研究使用稻瘟病菌Pem G1的氨基酸序列對核盤菌全基因組數(shù)據(jù)庫進行Blast_p,找到一個具有相同功能域和較高的序列相似度的蛋白,編碼基因SS1G_07345,將其命名為SsPemG1。故可推測Ss PemG1可能也是蛋白激發(fā)子。本實驗通過擴增核盤菌中SsPemG1編碼基因序列,構(gòu)建出SsPemG1-pSilent-1的沉默表達載體,利用PEG介導(dǎo)的核盤菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化實驗獲得了該基因的沉默突變菌株。通過潮霉素B抗性和熒光定量PCR實驗篩選出具有良好的沉默抑制效果的突變菌株M6和M9。通過分析沉默突變菌株的表型差異和生物信息學信息,明確SsPemG1在核盤菌中的功能。表型分析結(jié)果表明:在致病性實驗中,沉默突變體的致病性明顯較野生型強。通過進一步研究發(fā)現(xiàn),沉默突變體比野生型和Mock菌株具有更快的生長速度;對NaCl和SDS的耐受性變的更強;形成更多對于致病性至關(guān)重要的侵染墊;細胞壁降解酶類的活性變的更強。SsPem G1通過調(diào)控這4個因素共同導(dǎo)致其致病力變強。生物信息學預(yù)測結(jié)果表明,主要功能是結(jié)合RNA,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和翻譯,這與表型實驗的結(jié)果一致。本實驗的開展有助于進一步了解核盤菌SsPemG1的功能,為研究激發(fā)子提供一個新的方法,為核盤菌的防治提供理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：核盤菌 SsPemG1 沉默 致病性 激發(fā)子
【學位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S432.44
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 1 文獻綜述10-18
• 1.1 油菜菌核病和核盤菌的研究進展10-15
• 1.1.1 油菜菌核病的危害及其防治10-12
• 1.1.2 核盤菌的研究進展12-15
• 1.2 蛋白激發(fā)子的研究進展15-16
• 1.3 生物信息學研究進展16-18
• 2 引言18-19
• 3 材料與方法19-30
• 3.1 供試材料19
• 3.1.1 供試菌株19
• 3.1.2 供試植株19
• 3.1.3 化學試劑19
• 3.1.4 供試載體19
• 3.1.5 儀器設(shè)備19
• 3.1.6 常用緩沖溶液和培養(yǎng)基19
• 3.2 供試方法19-30
• 3.2.1 核盤菌NGA4菌絲總DNA和RNA的提取及cDNA的制備19-21
• 3.2.2 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞的制備及酶連、轉(zhuǎn)化21
• 3.2.3 SsPemG1基因的克隆和測序21
• 3.2.4 SsPemG1生物信息學預(yù)測21-23
• 3.2.5 SsPemG1在核盤菌無性生活史各階段相對表達量的測定23
• 3.2.6 沉默載體的構(gòu)建和大提質(zhì)粒23-25
• 3.2.7 PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化25-26
• 3.2.8 SsPemG1沉默突變體的篩選26
• 3.2.9 SsPemG1沉默突變體的表型分析26-30
• 4 結(jié)果與分析30-45
• 4.1 SsPemG1基因的克隆和測序30-31
• 4.2 生物信息學預(yù)測結(jié)果31-35
• 4.2.1 SsPemG1蛋白基本性質(zhì)31-32
• 4.2.2 SsPemG1結(jié)構(gòu)域預(yù)測32-33
• 4.2.3 SsPemG1蛋白亞細胞定位分析33
• 4.2.4 SsPemG1互作蛋白預(yù)測33-34
• 4.2.5 多序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建34-35
• 4.3 SsPemG1基因在核盤菌無性生活史各階段相對表達分析35-36
• 4.4 SsPemG1-pSilent-1 載體的構(gòu)建與驗證36-37
• 4.5 SsPemG1沉默轉(zhuǎn)化子的篩選與驗證37-38
• 4.6 SsPemG1沉默突變體生長表型及菌核發(fā)育觀察38-39
• 4.7 SsPemG1沉默對形成侵染墊和SsGgt1基因表達的影響39-40
• 4.8 SsPemG1沉默突變體對五種脅迫因子的耐受性分析40-41
• 4.9 SsPemG1沉默突變體草酸、果膠酶、纖維素酶及蛋白酶測定41-42
• 4.10 SsPemG1沉默對核盤菌NGA4致病力的影響42-43
• 4.11 其他致病相關(guān)基因的相對表達量的測定43-45
• 5 小結(jié)與討論45-47
• 5.1 全文小結(jié)45
• 5.2 討論45-47
• 參考文獻47-56
• 致謝56-57
• 附錄A 化學試劑和儀器設(shè)備57-58
• 附錄B 常用緩沖溶液和培養(yǎng)基58-60
• 附錄C 部分實驗步驟60-64
• 作者簡介64

【相似文獻】

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 徐玉平;核盤菌蛋白激發(fā)子同源物SsPemG1的功能分析[D];安徽農(nóng)業(yè)大學;2016年

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本文編號：731956