本文關(guān)鍵詞：利用核糖體工程技術(shù)提高熒光假單胞菌Pf-5菌株活性次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量

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【摘要】：熒光假單胞菌Pf-5(Pseudomonas protegens Pf-5)是一種重要的植物根際共生菌,它能夠產(chǎn)生多種具有抗菌作用的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物,包括藤黃綠膿菌素(Plt)、2,4-二乙�；冱S酚(Phl)、硝吡咯菌素(Prn)、嗜鐵素等。這些次級(jí)代謝產(chǎn)物能拮抗不同的病原菌,在農(nóng)作物土傳病害的生物防治研究中具有重要意義。野生型菌株中各類活性代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量通常較低,在生物防治應(yīng)用中效果有限。當(dāng)前,通過核糖體工程技術(shù)(Ribosome engineering)等手段進(jìn)行菌株改良提高次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量是一條十分有效的途徑。為了提高Pf-5菌株中活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量,本研究利用核糖體工程技術(shù)在高濃度的利福平篩選下,分離得到利福平自發(fā)抗性突變株60株。通過比較原始株P(guān)f-5和突變株的抑菌效果發(fā)現(xiàn),其中7株突變菌株較原始菌的抗真菌能力增強(qiáng)。對(duì)這7株突變菌株的DNA序列進(jìn)行測序分析,發(fā)現(xiàn)均在編碼RNA聚合酶β亞基的rpoB基因出現(xiàn)點(diǎn)突變,保守區(qū)域rif-cluster I區(qū)間第1591位的胞嘧啶突變?yōu)橄汆堰?相應(yīng)的編碼氨基酸殘基由組氨酸突變?yōu)樘於０�。利用HPLC對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量進(jìn)行比較分析,結(jié)果表明相比于原始菌株,突變菌R55的2個(gè)主要抑菌活性代謝物(B和D)合成能力都有不同程度的提高:其中產(chǎn)物B提高了2.5倍左右,產(chǎn)物D提高了1.4倍左右。利用質(zhì)譜等手段測定表明:產(chǎn)物B和D分別為:藤黃綠膿菌素、2,4-二乙酰藤黃酚。抑菌實(shí)驗(yàn)表明產(chǎn)物藤黃綠膿菌素、2,4-二乙酰藤黃酚對(duì)煙草黑脛病菌和枇杷炭疽病菌都顯示了不同程度的抑制效果。此外,本研究還在Pf-5菌株中過表達(dá)了R55的ropBR基因,構(gòu)建了工程菌株P(guān)f-rpoBR。工程菌能在高濃度的利福平抗性板上生長,CAS平板實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)工程菌的嗜鐵素產(chǎn)量有較大幅度的提升。本研究以熒光假單胞菌Pf-5為出發(fā)菌株,引入利福平抗性突變位點(diǎn),獲得一株兩種抗生素產(chǎn)量同時(shí)提高且抑菌活性大幅增強(qiáng)的突變株R55,并鑒定了其突變位點(diǎn),經(jīng)過反復(fù)傳代驗(yàn)證,突變株的利福平抗性能穩(wěn)定遺傳。研究結(jié)果體現(xiàn)了核糖體工程技術(shù)在革蘭氏陰性細(xì)菌選育上的重大潛在應(yīng)用價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】：熒光假單胞Pf-5 核糖體工程 利福平 次級(jí)代謝產(chǎn)物
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S476.1
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 第一章 引言10-24
• 1 植物病害與生物防治10-12
• 1.1 植物病害生物防治的概念及作用機(jī)理10
• 1.2 生防細(xì)菌在生物防治中的應(yīng)用10-12
• 2 熒光假單胞菌與生物防治12-19
• 2.1 熒光假單胞菌的主要類群12
• 2.2 熒光假單胞菌生物防治作用12-13
• 2.3 熒光假單胞菌生防機(jī)理13-15
• 2.4 熒光假單胞菌抗生性代謝產(chǎn)物在生防治中的應(yīng)用15-17
• 2.5 熒光假單胞菌的育種改良17-19
• 3 核糖體工程概述19-22
• 3.1 核糖體工程的概念19
• 3.2 核糖體工程的作用機(jī)制19-21
• 3.3 核糖體工程的應(yīng)用進(jìn)展21-22
• 4 立題依據(jù)和研究目的22-24
• 第二章 材料與方法24-40
• 1 材料24-31
• 1.1 菌株與質(zhì)粒24-25
• 1.2 培養(yǎng)基25-26
• 1.3 抗生素26
• 1.4 引物與測序26-27
• 1.5 工具酶與標(biāo)準(zhǔn)分子量27
• 1.6 常用試劑與試劑盒27-30
• 1.7 儀器與設(shè)備30-31
• 2 方法31-40
• 2.1 菌株的培養(yǎng)與保藏31
• 2.2 最低抑菌濃度（MIC）的測定31
• 2.3 抗性突變株的篩選31
• 2.4 抗性突變株的真菌抑制活力測定31-32
• 2.5 發(fā)酵產(chǎn)物的高效液相色譜分析32
• 2.6 抑菌活性產(chǎn)物的質(zhì)譜鑒定32-33
• 2.7 突變株的抑菌活性測試33
• 2.8 菌體全蛋白的提取及分析33-34
• 2.9 突變株與原始菌株生理特性的比較34-35
• 2.10 細(xì)菌基因組DNA的提取35-36
• 2.11 突變位點(diǎn)的鑒定36-38
• 2.12 過表達(dá)載體的構(gòu)建38
• 2.13 工程菌Pf5rpoB~R的構(gòu)建38-40
• 第三章 結(jié)果與分析40-55
• 1 利福平對(duì)熒光假單胞菌Pf-5 菌株最低抑制濃度的確定40
• 2 利福平自發(fā)抗性突變株的篩選40-41
• 3 突變位點(diǎn)的鑒定41-42
• 4 代謝產(chǎn)物的色譜分析42-44
• 5 代謝產(chǎn)物的抑菌活性研究44-46
• 6 原始菌株與突變菌株在不同時(shí)期的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量分析46-47
• 7 代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜分析47-48
• 8 突變株的表型特征比較48-50
• 9 重組質(zhì)粒pUCP24-rpoB~R的構(gòu)建50-51
• 10 工程菌株P(guān)f-rpoB~R的構(gòu)建51-52
• 11 工程菌株的活性產(chǎn)物產(chǎn)量分析52-53
• 12 突變菌蛋白表達(dá)水平的差異分析53-55
• 第四章 討論55-58
• 參考文獻(xiàn)58-66
• 縮略詞表66-67
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文67-68
• 本論文感謝以下基金項(xiàng)目的資助68-69
• 致謝69

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本文編號(hào)：621950