發(fā)布時(shí)間：2017-08-02 09:07

  本文關(guān)鍵詞：我國常見粉蚧類害蟲雙基因條形碼鑒定技術(shù)研究

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【摘要】：粉蚧屬半翅目Hemiptera、粉蚧科Pseudococcidae,是一類重要的世界性檢疫性害蟲。粉蚧類害蟲種類繁多,已知種類2000余種;且體形微小、形態(tài)多樣、寄主范圍廣、隱蔽性強(qiáng),極易隨國際貿(mào)易活動(dòng)傳播擴(kuò)散,給農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大威脅。通常,口岸截獲的粉蚧多為若蟲或殘?bào)w,加之隱存種/復(fù)合種的存在和較小的近緣種間差異,嚴(yán)重影響了基于形態(tài)學(xué)特征的粉蚧類害蟲識(shí)別鑒定的準(zhǔn)確性和時(shí)效性。本研究以線粒體COI基因和核糖體28S rRNA為靶標(biāo),研究探討了雙基因DNA條形碼在粉蚧鑒定中的作用,評(píng)價(jià)了該技術(shù)對(duì)重大潛在入侵害蟲大洋臀紋粉蚧的鑒定有效性;同時(shí),針對(duì)重大檢疫性害蟲木薯綿粉蚧研發(fā)出了其種特異性檢測(cè)鑒定技術(shù)體系。具體研究結(jié)果如下:(1)粉蚧類昆蟲全基因組DNA提取方法的評(píng)價(jià)研究。以雌性成蟲、卵、各齡期若蟲等為對(duì)象,分析比較了8種DNA提取方法,明確了SDS法最適于粉蚧類害蟲高齡若蟲和雌成蟲DNA提取,DeBarro法適于卵和低齡若蟲DNA提取,有效解決了粉蚧類害蟲體表蠟質(zhì)較厚,DNA得率不高的難題。(2)雙基因條形碼技術(shù)在我國常見粉蚧鑒定中的應(yīng)用。以來自國外11個(gè)種群、國內(nèi)93個(gè)種群的9屬22種粉蚧461個(gè)個(gè)體為對(duì)象,以COI基因5’端和28S基因D2-D3區(qū)段為靶標(biāo),通過堿基序列測(cè)定和分析,以及種內(nèi)種間遺傳距離計(jì)算,并同時(shí)整合數(shù)據(jù)庫中高質(zhì)量的相關(guān)種的靶標(biāo)序列,分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示,22種粉蚧的COI基因5’端序列具有48個(gè)單倍型,而28S基因D2-D3序列則具有33個(gè)單倍型。當(dāng)以COI基因5’端序列為靶標(biāo)時(shí),22種粉蚧的種內(nèi)遺傳距離為0.0000~0.0160,平均為0.0034;種間遺傳距離均大于2%,為0.0220~0.1780,平均為0.0921;種間遺傳距離是種內(nèi)遺傳距離的27.1倍;且種內(nèi)遺傳距離與種間遺傳距離之間不存在重疊區(qū)域。在基于COI-5’序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中,各物種均具有獨(dú)立的進(jìn)化分支。當(dāng)以28S基因D2-D3區(qū)段為靶標(biāo)時(shí),部分屬內(nèi)十分保守,種內(nèi)遺傳距離與種間遺傳距離之間存在重疊現(xiàn)象,不能對(duì)部分近緣種進(jìn)行有效區(qū)分;而屬間變異相對(duì)較大。同時(shí),研究還顯示,大洋臀紋粉蚧和柑橘臀紋粉蚧可能存在隱存種或復(fù)合種;而粉蚧屬可能存在多起源現(xiàn)象。進(jìn)而表明,COI基因較28S基因更適合于種間的物種鑒定;而COI基因和28S基因的聯(lián)合應(yīng)用,有利于提高DNA條形碼技術(shù)對(duì)粉蚧類害蟲的鑒定能力,實(shí)現(xiàn)對(duì)粉蚧類害蟲的準(zhǔn)確識(shí)別與鑒定。(3)DNA條形碼技術(shù)對(duì)近緣種粉蚧-重大潛在入侵害蟲大洋臀紋粉蚧和土著種柑橘臀紋粉蚧的鑒定有效性研究。以旅檢截獲的36頭大洋臀紋粉蚧為對(duì)象、其近緣種柑橘臀紋粉蚧為參照,序列分析表明,當(dāng)分別以COI基因5’端和3’端序列為靶標(biāo)時(shí),截獲大洋臀紋粉蚧的堿基序列與數(shù)據(jù)庫中靶標(biāo)種的序列相似性分別為100%和99~100%,而與近緣種柑橘臀紋粉蚧的相似性分別為97~98%和96~98%;且大洋臀紋粉蚧和柑橘臀紋粉蚧分別存在5個(gè)和12個(gè)穩(wěn)定的物種特異性鑒別位點(diǎn);系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,截獲的大洋臀紋粉蚧均與數(shù)據(jù)庫中的靶標(biāo)種聚為一支。當(dāng)以28S基因D2-D3區(qū)段序列為靶標(biāo)時(shí),臀紋粉蚧屬各物種間高度保守,無法區(qū)分大洋臀紋粉蚧與其近緣種柑橘臀紋粉蚧;種間遺傳距離僅為0.004。此外,進(jìn)一步的物種識(shí)別軟件評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,基于COI基因5’端和3’端序列的鑒定結(jié)果完全正確,而基于28S基因D2-D3區(qū)段序列的鑒定結(jié)果卻存在45.2~61.9%的模糊鑒定。表明,基于COI基因5’端和3’端的DNA條形碼技術(shù)完全可用于大洋臀紋粉蚧的準(zhǔn)確鑒定及檢測(cè)監(jiān)測(cè),對(duì)有效阻截其入侵和進(jìn)一步擴(kuò)散蔓延意義重大。(4)重大潛在入侵害蟲木薯綿粉蚧的快速PCR檢測(cè)技術(shù)研究�；跍y(cè)序獲得的COI基因5’端序列,設(shè)計(jì)木薯綿粉蚧的種特異性SS-COI引物1對(duì)(PMSSZW-1F/PMSSZW-1R),其擴(kuò)增片段大小為353 bp;以我國口岸經(jīng)常截獲的扶桑綿粉蚧等8種粉蚧為參照,研究驗(yàn)證該引物對(duì)的種特異性,以及檢測(cè)靈敏性和檢測(cè)閾值。結(jié)果顯示,該引物對(duì)只對(duì)木薯綿粉蚧具有擴(kuò)增能力,對(duì)我國口岸經(jīng)常截獲的其他8種粉蚧不具擴(kuò)增效果;同時(shí),對(duì)不同蟲態(tài)、齡期、成蟲殘?bào)w以及來自不同寄主植物的木薯綿粉蚧亦具良好的擴(kuò)增效果,其最低檢出閾值為135.22±10.41 pg/μL(相當(dāng)于1/20480頭雌性成蟲)。木薯綿粉蚧的種特異性快速檢測(cè)技術(shù)具有快速、可靠、準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn),能大大提高口岸檢驗(yàn)檢疫效率,該技術(shù)體系的建立為木薯綿粉蚧的檢測(cè)、監(jiān)測(cè)與有效阻截提供了技術(shù)支撐,對(duì)保障我國木薯產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。本研究圍繞粉蚧科昆蟲種類多、體形小、存在多型、多態(tài),對(duì)農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)威脅巨大,卻難以快速準(zhǔn)確識(shí)別的問題,研究構(gòu)建了較為完善的粉蚧科雙基因DNA條形碼鑒定技術(shù)體系。而重大潛在入侵物種木薯綿粉蚧種特異性快速檢測(cè)技術(shù)的研發(fā)與建立,及其與雙基因條形碼技術(shù)等分子鑒定手段的聯(lián)合應(yīng)用,必將在檢疫性粉蚧類害蟲的檢測(cè)監(jiān)測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警中發(fā)揮巨大作用,并為“一帶一路”區(qū)域農(nóng)業(yè)綠色生產(chǎn)與健康發(fā)展,以及國家糧食安全與生態(tài)安全提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。
【關(guān)鍵詞】：粉蚧科 雙基因DNA條形碼 mtDNA COI 28S rRNA 種特異性SS-COI引物 分子鑒定
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S433.39
【目錄】：

• 摘要7-9
• abstract9-16
• 第一章 引言16-27
• 1.1 DNA條形碼技術(shù)概況16-17
• 1.2 DNA條形碼技術(shù)在重大農(nóng)林入侵害蟲研究中的應(yīng)用17-25
• 1.2.1 在介殼蟲類昆蟲研究中的應(yīng)用17-19
• 1.2.2 在實(shí)蠅類害蟲研究中的應(yīng)用19-21
• 1.2.3 在粉虱類害蟲研究中的應(yīng)用21-22
• 1.2.4 在薊馬類昆蟲研究中的應(yīng)用22-24
• 1.2.5 在其他重大農(nóng)林入侵害蟲研究中的應(yīng)用24-25
• 1.3 粉蚧類昆蟲DNA條形碼鑒定技術(shù)研究內(nèi)容及研究方法25-27
• 1.3.1 研究內(nèi)容25-26
• 1.3.2 技術(shù)路線26-27
• 第二章 粉蚧類昆蟲全基因組DNA提取方法的評(píng)價(jià)研究27-35
• 2.1 材料與方法27-29
• 2.1.1 供試蟲源27-28
• 2.1.2 全基因組DNA提取28
• 2.1.3 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)28
• 2.1.4 DNA純度檢測(cè)和濃度測(cè)定28-29
• 2.1.5 PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)29
• 2.1.6 SDS法DNA檢測(cè)效果的測(cè)定29
• 2.2 結(jié)果與分析29-33
• 2.2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)29-30
• 2.2.2 DNA純度和得率30-31
• 2.2.3 PCR擴(kuò)增效果31-32
• 2.2.4 SDS法的DNA檢測(cè)效果32-33
• 2.3 討論33-35
• 第三章 雙基因條形碼技術(shù)在我國常見粉蚧鑒定中的應(yīng)用35-58
• 3.1 材料與方法36-43
• 3.1.1 供試蟲源36
• 3.1.2 DNA提取36-42
• 3.1.3 PCR擴(kuò)增、電泳檢測(cè)以及序列測(cè)定42
• 3.1.4 COI基因和 28S基因序列分析42-43
• 3.2 結(jié)果與分析43-53
• 3.2.1 PCR擴(kuò)增、序列測(cè)定及序列分析43-44
• 3.2.2 種內(nèi)與種間遺傳距離44-48
• 3.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析48-53
• 3.3 討論53-58
• 第四章 DNA條形碼技術(shù)對(duì)重大潛在入侵害蟲大洋臀紋粉蚧的鑒定有效性研究58-69
• 4.1 材料與方法59-61
• 4.1.1 供試蟲源59-60
• 4.1.2 DNA提取60
• 4.1.3 PCR擴(kuò)增、電泳檢測(cè)及序列測(cè)定60
• 4.1.4 序列處理與分析60-61
• 4.2 結(jié)果與分析61-66
• 4.2.1 PCR擴(kuò)增及序列分析61-62
• 4.2.2 序列單倍型和相似性分析62-63
• 4.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析63-65
• 4.2.4 物種鑒定的有效性評(píng)價(jià)65-66
• 4.2.5 物種鑒定的準(zhǔn)確率評(píng)價(jià)66
• 4.3 討論66-69
• 第五章 重大潛在入侵害蟲木薯綿粉蚧種特異性檢測(cè)技術(shù)研究69-78
• 5.1 材料與方法71-73
• 5.1.1 供試蟲源71-72
• 5.1.2 DNA提取72
• 5.1.3 粉蚧類昆蟲COI基因 5’端序列的擴(kuò)增72
• 5.1.4 木薯綿粉蚧特異性SS-COI引物的設(shè)計(jì)72-73
• 5.1.5 木薯綿粉蚧SS-COI引物的種特異性檢驗(yàn)73
• 5.1.6 木薯綿粉蚧SS-COI引物的靈敏性的檢測(cè)73
• 5.2 結(jié)果與分析73-76
• 5.2.1 粉蚧類昆蟲COI基因 5’端序列的擴(kuò)增及分析73-74
• 5.2.2 木薯綿粉蚧SS-COI引物的種特異性檢驗(yàn)74-75
• 5.2.3 SS-COI引物對(duì)不同蟲態(tài)、齡期、成蟲殘?bào)w以及不同寄主來源木薯綿粉蚧的擴(kuò)增75
• 5.2.4 SS-COI 引物對(duì)木薯綿粉蚧的檢測(cè)閾值75-76
• 5.3 討論76-78
• 第六章 結(jié)論與展望78-80
• 6.1 結(jié)論78-79
• 6.1.1 粉蚧類昆蟲全基因組DNA提取方法的比較78
• 6.1.2 雙基因條形碼技術(shù)在我國常見粉蚧鑒定中的應(yīng)用78
• 6.1.3 DNA條形碼技術(shù)對(duì)重大潛在入侵害蟲大洋臀紋粉蚧的鑒定有效性78
• 6.1.4 重大檢疫性害蟲木薯綿粉蚧的種特異性檢測(cè)技術(shù)78-79
• 6.2 創(chuàng)新點(diǎn)79
• 6.3 展望79-80
• 參考文獻(xiàn)80-103
• 致謝103-104
• 作者簡歷104

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 褚棟;劉國霞;付海濱;徐衛(wèi);;線粒體細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ(mtCOⅠ)序列分析揭示扶桑綿粉蚧復(fù)合種存在隱存譜系(英文)[J];昆蟲學(xué)報(bào);2009年11期

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本文編號(hào)：608493