本文關(guān)鍵詞：醛酮還原酶Bbakr1參與球孢白僵菌高滲和重金屬鉻脅迫反應(yīng)

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【摘要】：球孢白僵菌是一種廣泛用于農(nóng)、林以及衛(wèi)生害蟲生物防治的昆蟲病原真菌,也是研究絲狀真菌與宿主、環(huán)境互作的模式菌株之一。醛酮還原酶是一類NADP-依賴型氧化還原酶,廣泛存在于原核和真核生物中,參與糖代謝及多種逆境脅迫反應(yīng),但在真菌中的功能研究鮮有報道。前期研究表明,與酵母Hog1同源的MAPK信號途徑Bbhog1是球孢白僵菌逆境適應(yīng)性和致病性的重要調(diào)控途徑。為揭示Bbhog1調(diào)控球孢白僵菌逆境脅迫反應(yīng)可能的分子學(xué)基礎(chǔ),課題組構(gòu)建了野生型與ΔBbhog1在高滲脅迫條件下SSH文庫,獲得了15個在hog1信號阻斷突變體中表達(dá)顯著下調(diào)的基因。其中編號為H231的克隆與多種真菌的醛酮還原酶AKR編碼基因高度同源,將其命名為Bbakr1。本論文利用基因破壞、回復(fù)互補(bǔ)和超量表達(dá)的策略研究了Bbakr1與球孢白僵菌發(fā)育分化、逆境脅迫反應(yīng)和毒力的關(guān)系。主要的研究結(jié)果如下:1.Bbakr1序列分析與表達(dá)特性分析序列分析表明,Bbakr1含有930 bp的開放閱讀框,編碼310個氨基酸的多肽,推測的分子量約34.1 KDa。Bbakr1與多種真菌AKR同源蛋白高度同源。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示,Bbakr1與昆蟲病原真菌的蛹蟲草(Cordyceps militaris)的AKR聚為一簇,推測其與蛹蟲草AKR在進(jìn)化上具有較近的親緣關(guān)系。qRT-PCR分析表明,Bbakr1的表達(dá)受高滲和重金屬鉻脅迫誘導(dǎo),且表達(dá)量隨脅迫時間的變化而變化。由此推測,Bbakr1可能參與高滲脅迫反應(yīng)與重金屬鉻的解毒反應(yīng)。2.Bbakr1參與球孢白僵菌的產(chǎn)孢和發(fā)育分化為明確Bbakr1與球孢白僵菌發(fā)育分化及逆境脅迫反應(yīng)和毒力的關(guān)系,本研究構(gòu)建了基因破壞(ΔBbakr1)、回復(fù)互補(bǔ)(Comp)和超量表達(dá)(OE-Bbakr1)轉(zhuǎn)化子,與親本野生菌株(WT)進(jìn)行了比較研究,結(jié)果表明,Bbakr1介導(dǎo)菌株孢子產(chǎn)生與發(fā)育分化。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上,ΔBbakr1和OE-Bbakr1分生孢子產(chǎn)量比野生型菌株分別降低41%(P0.01)和10%(P0.05);在富營養(yǎng)培養(yǎng)基上,ΔBbakr1的分生孢子產(chǎn)量比WT降低15%(P0.01),而OE-Bbakr1和Comp與WT無顯著差異。由此表明,Bbakr1介導(dǎo)球孢白僵菌分生孢子的產(chǎn)生。分生孢子萌發(fā)速率測定結(jié)果顯示,破壞Bbakr1導(dǎo)致菌株的萌發(fā)速率降低,ΔBbakr1萌發(fā)中時比WT滯后0.72 h(P0.05),而OE-Bbakr1和Comp的萌發(fā)速率與WT無明顯差異�？梢�,Bbakr1介導(dǎo)球孢白僵菌分生孢子的萌發(fā)。Bbakr1與球孢白僵菌芽生孢子產(chǎn)生和生物量積累相關(guān)。破壞Bbakr1導(dǎo)致菌株芽生孢子產(chǎn)量顯著降低,同時降低了菌絲生物量積累,而OE-Bbakr1和Comp與WT無明顯差異。3.Bbakr1與球孢白僵菌的高滲脅迫反應(yīng)有關(guān)破壞Bbakr1增強(qiáng)了菌株對高滲脅迫敏感性,而OE-Bbakr1和Comp對高滲脅迫的敏感性與WT無明顯差異。真菌細(xì)胞通常積累糖醇來適應(yīng)高滲環(huán)境,胞內(nèi)糖醇積累測定結(jié)果表明,破壞Bbakr1降低了胞內(nèi)赤蘚糖醇的積累,而超量表達(dá)Bbakr1則提高了胞內(nèi)赤蘚糖醇的積累。另外,破壞和超量表達(dá)Bbakr1干擾了胞內(nèi)甘油、阿拉伯糖醇和甘露糖醇積累水平。由此推測,Bbakr1可能通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)糖醇(尤其是赤蘚糖醇)的積累介導(dǎo)菌株的高滲脅迫反應(yīng)。4.Bbakr1參與球孢白僵菌的重金屬鉻脅迫反應(yīng)破壞Bbakr1提高了球孢白僵菌的對重金屬鉻的敏感性,而OE-Bbakr1和Comp與WT對鉻的敏感性無顯著差異。在重金屬鉻脅迫條件下,ΔBbakr1生長速率比WT降低約22%(P0.01)。重金屬對細(xì)胞的毒害主要是由于引起胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和活性醛的積累。胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平和丙二醛積累的測定結(jié)果表明,破壞Bbakr1導(dǎo)致菌株胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物降低,丙二醛含量提高。重金屬鉻脅迫4 h和6h時,ΔBbakr1胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的含量分別比WT降低43.21%和12.74%(P0.01),丙二醛積累則分別是WT的6.0倍和3.4倍(P0.01)。由此推測,Bbakr1可能參與還原重金屬鉻引起脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的活性醛,影響菌株對重金屬鉻的解毒作用。5.破壞和超量表達(dá)Bbakr1不影響球孢白僵菌的毒力生物測定的結(jié)果顯示,破壞和超量表達(dá)Bbakr1對大蠟螟幼蟲的毒力均無明顯影響。
【關(guān)鍵詞】：球孢白僵菌 醛酮還原酶 高滲 重金屬鉻
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S476.12
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-20
• 1.1 昆蟲病原真菌12
• 1.2 醛酮還原酶超家族的研究進(jìn)展12-16
• 1.2.1 醛酮還原酶超家族概述12-13
• 1.2.2 醛酮還原酶的結(jié)構(gòu)13-14
• 1.2.3 醛酮還原酶的生物學(xué)功能14-16
• 1.3 重金屬及其毒害16-18
• 1.3.1 重金屬16-17
• 1.3.2 重金屬的毒害作用17-18
• 1.4 小結(jié)18-20
• 第二章 引言20-22
• 2.1 研究目的和意義20-21
• 2.2 技術(shù)路線21-22
• 第三章 材料與方法22-36
• 3.1 材料22-24
• 3.1.1 供試菌株22
• 3.1.2 生物測定用蟲22
• 3.1.3 質(zhì)粒載體22
• 3.1.4 培養(yǎng)基及緩沖液22-23
• 3.1.5 引物23-24
• 3.2 方法24-36
• 3.2.1 菌株的保存與培養(yǎng)24
• 3.2.2 球孢白僵菌DNA和RNA的提取24-25
• 3.2.3 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化25-26
• 3.2.4 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化26-27
• 3.2.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)球孢白僵菌的遺傳轉(zhuǎn)化27
• 3.2.6 球孢白僵菌芽生孢子感受態(tài)制備及遺傳轉(zhuǎn)化27-28
• 3.2.7 Real time RT-PCR表達(dá)分析28-29
• 3.2.8 Bbakr1超量表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化29
• 3.2.9 ΔBbhog1中超量表達(dá)Bbakr1載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化29
• 3.2.10 球孢白僵菌菌落的形態(tài)觀察和生長速率測定29
• 3.2.11 球孢白僵菌萌發(fā)速率測定29-30
• 3.2.12 球孢白僵菌產(chǎn)孢量測定30
• 3.2.13 分生孢子疏水性測定30-31
• 3.2.14 分生孢子附著性測定31
• 3.2.15 生物測定31-32
• 3.2.16 球孢白僵菌胞內(nèi)糖醇測定32
• 3.2.17 脂質(zhì)過氧化物(LPO)含量測定32-33
• 3.2.18 丙二醛(MDA)含量測定33-34
• 3.2.19 統(tǒng)計分析34-36
• 第四章 結(jié)果與分析36-52
• 4.1 Bbakr1的序列分析36-37
• 4.2 Bbakr1的表達(dá)特性37-39
• 4.3 超量表達(dá)轉(zhuǎn)化子篩選39-40
• 4.4 Bbakr1參與球孢白僵菌的發(fā)育分化40-45
• 4.4.1 Bbakr1與球孢白僵菌的生長發(fā)育相關(guān)40-43
• 4.4.2 Bbakr1不參與球孢白僵菌分生孢子表面特性的形成43-45
• 4.5 破壞和超量表達(dá)Bbakr1不影響球孢白僵菌的毒力45
• 4.6 破壞Bbakr1影響球孢白僵菌的高滲適應(yīng)性45-47
• 4.7 Bbakr1參與球孢白僵菌胞內(nèi)糖醇積累47-48
• 4.8 破壞Bbakr1影響球孢白僵菌的重金屬鉻脅迫反應(yīng)48-49
• 4.9 Bbakr1參與球孢白僵菌對重金屬鉻的解毒49-52
• 第五章 討論52-56
• 5.1 Bbakr1參與球孢白僵菌生長發(fā)育的調(diào)控52-53
• 5.2 Bbakr1參與球孢白僵菌高滲適應(yīng)性的調(diào)控53
• 5.3 Bbakr1解毒重金屬鉻的作用機(jī)理53-55
• 5.4 Bbakr1在球孢白僵菌中的生物學(xué)意義55-56
• 第六章 結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-65
• 致謝65-67
• 附錄Ⅰ 英文縮寫67-71
• 附錄Ⅱ 研究生期間論文發(fā)表情況71

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