本文關鍵詞：解淀粉芽孢桿菌NC6蛋白激發(fā)子PeBA1的分離鑒定及功能研究

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【摘要】：解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)是植物根際生長促進菌中非常重要的一類生防菌。研究表明,芽孢桿菌生防機制主要包括:競爭、拮抗、誘導抗病性及促進生長等4個方面。目前尚未有關于解淀粉芽孢桿菌大分子蛋白激發(fā)子的報道,本研究首次從解淀粉芽孢桿菌NC6菌株中分離純化出一種能夠誘導煙草產(chǎn)生系統(tǒng)抗病反應的新型蛋白激發(fā)子PeBA1,為進一步闡述解淀粉芽孢桿菌誘導抗病性提供一定的理論基礎。具體實驗內(nèi)容與結果如下:1.蛋白激發(fā)子的分離純化及質(zhì)譜分析通過硫酸銨沉淀,陰離子柱交換層析,以及活性膠回收等一系列蛋白純化方法,從解淀粉芽孢桿菌NC6菌株中獲得一種能夠誘導煙草葉片產(chǎn)生典型過敏反應的蛋白質(zhì)激發(fā)子。并對該激發(fā)子進行質(zhì)譜分析,獲得其氨基酸序列,并命名為PeBA1(Protein elicitor from Bacillus amyloliquefaciens 1)。2.構建PeBA1原核表達及純化系統(tǒng)克隆Pe BA1基因,并將目的基因與原核表達載體E1連接,最后轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21(DE3)進行原核表達。進一步通過細胞超聲破碎,Ni柱親和層析,超濾除鹽濃縮獲得高濃度PeBA1重組蛋白。SDS-PAGE檢測及誘導煙草葉片過敏性壞死活性測試實驗驗證原核表達的準確性。3.PeBA1的理化性質(zhì)及誘導煙草防御反應進一步研究PeBA1重組蛋白的理化性質(zhì)及誘導煙草防御反應。PeBA1重組蛋白能夠在4、25、50、80、100℃水浴中孵育15min后保持良好的穩(wěn)定性。其所能夠引起枯斑三生煙煙草葉片過敏性壞死反應的最低濃度為5μM。PeBA1重組蛋白能夠誘導煙草防御早期事件如活性氧爆發(fā)(包括過氧化氫、超氧負離子的產(chǎn)生)。同時PeBA1重組蛋白可以誘導產(chǎn)生大量的次生代謝產(chǎn)物,包括大量的酚類物質(zhì)形成等,其能夠增強細胞壁強度,阻止病原菌的侵染。4.PeBA1誘導煙草產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性通過誘導煙草抗病性測試,我們發(fā)現(xiàn)PeBA1重組蛋白能夠誘導煙草產(chǎn)生對灰霉病菌和煙草花葉病毒的抗性。PeBA1重組蛋白處理的煙草葉片接種灰霉菌后,病斑直徑明顯小于蛋白緩沖液處理組,PeBA1處理的煙草葉片接種TMV后所引起病斑數(shù)和病斑大小均少于或小于緩沖液處理,證明PeBA1重組蛋白能夠誘導煙草產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性。進一步研究發(fā)現(xiàn),PeBA1重組蛋白處理煙草,能夠誘導水楊酸途徑相關抗病性基因如PR1a、PR1b和PR5和PAL,以及茉莉酸途徑相關部分抗病性基因如COI1和PDF1.2的轉錄上調(diào),同時也能夠引起在水楊酸介導的系統(tǒng)獲得抗病性和植物根圍菌引起的誘導系統(tǒng)抗病性中起重要作用的NPR1的轉錄上調(diào)。
【關鍵詞】：蛋白激發(fā)子 過敏反應 活性氧爆發(fā) 誘導系統(tǒng)抗病性
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S476.1
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 第一章 引言12-20
• 1.1 解淀粉芽孢桿菌12-14
• 1.1.1 解淀粉芽孢桿菌促生長活性12-13
• 1.1.2 解淀粉芽胞桿菌抗菌活性13
• 1.1.3 解淀粉芽孢桿菌誘導系統(tǒng)抗性13-14
• 1.2 微生物源蛋白質(zhì)激發(fā)子14-15
• 1.2.1 真菌源蛋白激發(fā)子14-15
• 1.2.2 細菌源蛋白質(zhì)激發(fā)子15
• 1.3 激發(fā)子引起的植物系統(tǒng)抗病性15-18
• 1.3.1 誘導系統(tǒng)抗病性和獲得系統(tǒng)抗病性15-16
• 1.3.2 激發(fā)子誘導的植物抗病相關事件16-17
• 1.3.3 植物抗病性信號途徑17-18
• 1.4 研究目的及意義18-19
• 1.5 試驗方案19-20
• 第二章 解淀粉芽孢桿菌蛋白激發(fā)子的分離純化及質(zhì)譜分析20-26
• 2.1 實驗材料20
• 2.1.1 菌株與植物材料20
• 2.1.2 實驗試劑和儀器20
• 2.1.3 培養(yǎng)基與試劑配方20
• 2.2 實驗方法20-22
• 2.2.1 解淀粉芽孢桿菌NC6的發(fā)酵液培養(yǎng)20-21
• 2.2.2 蛋白激發(fā)子的分離純化21-22
• 2.3 實驗結果與分析22-24
• 2.3.1 解淀粉芽孢桿菌激發(fā)子的分離與純化22-23
• 2.3.2 解淀粉芽孢桿菌激發(fā)子的質(zhì)譜鑒定23-24
• 2.4 本章小結與討論24-26
• 第三章 蛋白激發(fā)子Pe BA1的基因克隆與原核表達26-35
• 3.1 實驗材料26-27
• 3.1.1 菌株與植物材料26
• 3.1.2 實驗試劑和儀器26
• 3.1.3 培養(yǎng)基及試劑配方26-27
• 3.2 解淀粉芽孢桿菌基因組提取27
• 3.3 Pe BA1基因克隆及載體構建27-28
• 3.3.1 Pe BA1基因克隆27
• 3.3.2 Pe BA1基因膠回收及連接轉化27-28
• 3.4 質(zhì)粒提取及轉化表達28-29
• 3.5 Pe BA1的原核表達及純化29-30
• 3.5.1 Pe BA1的原核重組表達29
• 3.5.2 Pe BA1重組蛋白的純化及濃度測定29-30
• 3.6 結果與分析30-33
• 3.6.1 蛋白激發(fā)子Pe BA1基因的克隆30
• 3.6.2 Pe BA1原核表達載體的構建30-32
• 3.6.3 Pe BA1重組蛋白的表達純化32-33
• 3.7 本章小結與討論33-35
• 第四章 Pe BA1重組蛋白激發(fā)子理化性質(zhì)及誘導煙草防御反應35-44
• 4.1 實驗材料35
• 4.1.1 植物材料35
• 4.1.2 實驗試劑和儀器35
• 4.1.3 培養(yǎng)基及試劑配方35
• 4.2 實驗方法35-37
• 4.2.1 Pe BA1重組蛋白激發(fā)子理化性質(zhì)35-36
• 4.2.2 Pe BA1重組蛋白誘導煙草產(chǎn)生早期防衛(wèi)反應36-37
• 4.3 結果與分析37-42
• 4.3.1 Pe BA1重組蛋白引起典型的HR壞死37-38
• 4.3.2 Pe BA1重組蛋白的熱穩(wěn)定性38-39
• 4.3.3 Pe BA1重組蛋白引起過敏性壞死反應最低濃度39-40
• 4.3.4 Pe BA1重組蛋白誘導活性氧積累40-41
• 4.3.5 Pe BA1重組蛋白誘導煙草細胞內(nèi)酚類物質(zhì)的產(chǎn)生和積累41-42
• 4.4 本章小結與討論42-44
• 第五章 Pe BA1誘導煙草產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性44-52
• 5.1 實驗材料44
• 5.1.1 植物及菌株材料44
• 5.1.2 實驗試劑和儀器44
• 5.1.3 培養(yǎng)基及試劑配方44
• 5.2 實驗方法44-46
• 5.2.1 Pe BA1誘導煙草產(chǎn)生對灰霉病菌的抗性44-45
• 5.2.2 Pe BA1誘導煙草產(chǎn)生對煙草花葉病毒（TMV）抗性45
• 5.2.3 熒光定量PCR檢測Pe BA1誘導抗病相關基因表達45-46
• 5.3 實驗結果與分析46-51
• 5.3.1 Pe BA1誘導煙草產(chǎn)生對灰霉病菌的抗性46-47
• 5.3.2 Pe BA1誘導煙草產(chǎn)生對煙草花葉病毒抗性47-49
• 5.3.3 Pe BA1誘導抗病相關基因轉錄上調(diào)49-51
• 5.4 本章小結與討論51-52
• 第六章 全文結論52-53
• 參考文獻53-59
• 致謝59-60
• 作者簡歷60

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