本文關鍵詞：四烯大環(huán)內酯類化合物的分離純化和對植物病原真菌的抑菌活性研究

  更多相關文章： 淀粉酶產色鏈霉菌1628 四烯大環(huán)內酯類化合物 HPLC 抑菌活性 核糖體工程

【摘要】：項目組從浙江天目山采集的土壤中分離到一株對多種植物病原真菌具有較強抑制作用的放線菌,鑒定為淀粉酶產色鏈霉菌1628(Streptomyces diastatochromogenes 1628)。前期研究中發(fā)現(xiàn)該菌株發(fā)酵液的正丁醇萃取物中含有多種四烯大環(huán)內酯類化合物,本研究對正丁醇萃取物進行分離純、純化,獲得3種四烯大環(huán)內酯類化合物單體,并對它們的抗菌活性進行了研究,進一步利用核糖體工程技術(Ribosome engineering)對淀粉酶產色鏈霉菌1628進行了遺傳改造,提高了其產素水平。淀粉酶產色鏈霉菌1628發(fā)酵液正丁醇萃取物經過一次大孔樹脂AB-8色譜柱層析、兩次ODS色譜柱層析、TLC分析和HPLC檢測。最終得到三種四烯大環(huán)內酯類化合物單體,編號為ODS5-8、ODS5-7-2、ODS-5-7-4。通過質譜、核磁共振分析,結合文獻報道其中ODS5-8被鑒定為四霉素A(Tetramycin A),ODS5-7-2被鑒定為新的四霉素類抗生素,命名為四霉素P(Tetramycin P),ODS5-7-4被鑒定為四烯菌素B(Tetrin B)。建立了四烯大環(huán)內酯類化合物高效液相色譜檢測方法,分析方法為:采用Waters Sun Fire C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流動相A為甲醇,B為水,梯度洗脫,流速:1 ml/min;檢測波長:304 nm,進樣量:5μl,柱溫:30℃。繪制Tetramycin A、Tetramycin P、Tetrin B HPLC標準曲線,在25~500 mg/L濃度線性范圍內,R2依次為0.9914、0.9862、0.9963,線性關系良好,平均加樣回收率依次為100.83%、100.15%、100.51%,RSD(%)分別為4.57、4.12、7.89,方法準確可靠。本測定方法簡單、重復性強,可用于發(fā)酵液中三種四烯化合物在HPLC方法中的定性定量分析。利用菌絲生長速率法研究了Tetramycin A、Tetramycin P對水稻紋枯病菌(Rhizoctorzia solani)、黃瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani Kühn)、黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea Pers.)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)5種常見植物病原真菌的抑菌活性。結果表明Tetramycin A、Tetramycin P對5種植物病原菌菌絲生長抑制效果較好。Tetramycin A抑制5種病原菌菌絲生長的EC50值分別為3.93、2.13、3.27、5.36、5.99 mg/L,隨著濃度的上升對5種植物病原真菌抑制效果增加,濃度為25 mg/L時平均抑制率為97.7%。Tetramycin P抑制5種病原菌菌絲生長的EC50值分別為3.83、3.29、3.31、4.96、5.65 mg/L,隨著濃度的上升對5種植物病原真菌抑制效果增加,濃度為30 mg/L時平均抑制率為97.3%。利用孢子萌發(fā)率測定法測定Tetramycin A、Tetramycin P對黃瓜枯萎病菌和番茄灰霉病菌的孢子萌發(fā)率的影響,結果表明對兩種病原菌孢子萌發(fā)抑制效果較好。Tetramycin A在濃度為125 mg/L時,對番茄灰霉病菌孢子萌發(fā)抑制效果較好,孢子萌發(fā)率為0%,黃瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)率為4%,效果稍弱但仍顯著低于對照。Tetramycin P在濃度為75mg/L時,對番茄灰霉病菌孢子抑制效果較好萌發(fā)率為0%,黃瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)率為5%,效果稍弱但仍顯著低于對照。實驗表明Tetramycin A、Tetramycin P對常見的5種植物病原菌均有較好的抑菌活性。淀粉酶產色鏈霉菌1628可以合成四種不同的抗生素包括豐加霉素、Tetramycin A、Tetramycin P和Tetrin B。利用核糖體工程技術由鏈霉素、利福平、巴龍霉素、紅霉素、慶大霉素和四環(huán)素6種抗生素誘導淀粉酶產色鏈霉菌1628突變,得到抗性突變株SD10、SD88、SD99、SD143、SD160、SD189和SD218,其中SD10、SD143為低濃度鏈霉素和高濃度鏈霉素誘導突變得到。7株突變株中,由紅霉素誘導得到的突變株SD160產生的豐加霉素和Tetramycin A的濃度達到678 mg/L和1005 mg/L,分別為野生型1628產量的3.8和5.4倍;由巴龍霉素誘導得到的突變株SD99產生的Tetramycin P和Tetrin B的濃度達到1015 mg/L和583 mg/L,分別為野生型1628產量的3.8和5.1倍。結果表明核糖體工程技術可以有效的提高淀粉酶產色鏈霉菌1628中四種抗生素的產量,均較原始菌株提高了3~5倍不等,為四種抗生素實現(xiàn)生產化奠定了良好的基礎。
【關鍵詞】：淀粉酶產色鏈霉菌1628 四烯大環(huán)內酯類化合物 HPLC 抑菌活性 核糖體工程
【學位授予單位】：中國計量大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：TQ927;S432.44
【目錄】：

• 致謝6-7
• 摘要7-9
• Abstract9-16
• 1 前言16-24
• 1.1 農用抗生素16-18
• 1.1.1 農用抗生素的研究背景16
• 1.1.2 農用抗生素使用的研究進展16-18
• 1.1.3 農用抗生素使用面臨問題18
• 1.2 多烯大環(huán)內酯類化合物18-20
• 1.2.1 多烯大環(huán)內酯類化合物概述19
• 1.2.2 多烯大環(huán)內酯類化合物功能特點19-20
• 1.3 核糖體工程技術20-23
• 1.3.1 核糖體工程技術的研究背景20-21
• 1.3.2 核糖體工程技術的研究內容21-22
• 1.3.3 核糖體工程技術的研究進展22-23
• 1.4 本課題研究的內容及意義23-24
• 2 四烯大環(huán)內酯類化合物的分離純化24-38
• 2.1 實驗材料25
• 2.1.1 菌種25
• 2.1.2 主要試劑25
• 2.1.3 培養(yǎng)基25
• 2.1.4 主要儀器25
• 2.2 試驗方法25-27
• 2.2.1 1628 液體發(fā)酵25-26
• 2.2.2 正丁醇萃取物的制備26
• 2.2.3 正丁醇浸膏的大孔樹脂AB-8 柱層析26
• 2.2.4 大孔樹脂AB-8 分離得到餾分的ODS分離純化26-27
• 2.2.5 抗生素單體的結構鑒定27
• 2.3 結果與分析27-36
• 2.3.1 大孔樹脂AB-8 柱層析結果27-29
• 2.3.2 ODS柱層析結果29-32
• 2.3.3 餾分ODS5-8、ODS572、ODS57-4 的結構鑒定32-36
• 2.4 討論36-38
• 3 四烯大環(huán)內酯類化合物HPLC檢測方法的建立38-43
• 3.1 儀器與試藥38
• 3.2 方法與結果38-41
• 3.2.1 標準品溶液制備38
• 3.2.2 樣品溶液制備38-39
• 3.2.3 色譜條件39
• 3.2.4 HPLC標準曲線繪制39-40
• 3.2.5 精密度、穩(wěn)定性、重復性實驗40-41
• 3.2.6 回收率實驗41
• 3.2.7 樣品測定41
• 3.3 討論41-43
• 3.3.1 檢測波長的選擇41
• 3.3.2 流動相的選擇41-42
• 3.3.3 檢測方法評價42-43
• 4 四烯大環(huán)內酯類化合物對植物病原真菌抑菌活性研究43-50
• 4.1 實驗材料43
• 4.2 試驗內容43-44
• 4.2.1 Tetramycin A、Tetramycin P對植物病原真菌菌絲生長率的影響43-44
• 4.2.2 Tetramycin A、Tetramycin P對植物病原真菌孢子萌發(fā)率的影響44
• 4.3 數(shù)據與分析44-49
• 4.3.1 Tetramycin A、Tetramycin P對植物病原真菌菌絲生長率的影響44-47
• 4.3.2 Tetramycin A、Tetramycin P對植物病原真菌孢子萌發(fā)率的影響47-49
• 4.4 討論49-50
• 5 利用核糖體工程技術提高1628次級代謝產物的產量50-55
• 5.1 實驗材料50-51
• 5.1.1 菌株及抗生素50
• 5.1.2 培養(yǎng)基50-51
• 5.1.3 HPLC分析方法51
• 5.2 試驗方法51-52
• 5.3 結果52-53
• 5.4 討論53-55
• 6 總結與展望55-58
• 6.1 總結55-56
• 6.2 展望56-58
• 參考文獻58-63
• 作者簡歷63

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