本文關鍵詞：四環(huán)素耐藥基因在禽畜糞便、堆肥和土壤中的歸趨，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：細菌耐藥性是目前全人類面臨的最緊迫的公共衛(wèi)生問題之一。耐藥基因作為一種新型污染物質,在環(huán)境中的遷移和歸趨日益受到研究者的關注。四環(huán)素在我國的禽畜養(yǎng)殖業(yè)中用量較大,是一種典型的廣譜抗生素,對四環(huán)素耐藥基因的分型和耐藥機制研究的較為透徹,但對耐藥基因在環(huán)境中遷移、歸趨規(guī)律等的研究還遠遠不夠。因此,本研究以四環(huán)素耐藥(tet-R)基因和乳糖發(fā)酵型腸桿菌(LFE)為研究對象,采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術和現(xiàn)代分子生物技術,研究了上海市2家養(yǎng)豬場和養(yǎng)雞場的禽畜糞便、糞便堆肥和施用堆肥土壤中耐四環(huán)素乳糖發(fā)酵型腸桿菌(TR-LFE)中四環(huán)素耐藥基因的分布以及禽畜糞便、堆肥和土壤中四環(huán)素耐藥基因的變化,得出以下結論：(1) TR-LFE/LFE比值在豬糞、豬糞堆肥和施用豬糞堆肥的土壤中呈逐級降低趨勢,在雞糞和雞糞堆肥中也是如此。(2)分別從養(yǎng)豬場樣品中和養(yǎng)雞場樣品分離出540株和340株TR-LFE,選取不同耐藥機制的10種tet-R基因的特異性引物,采用普通PCR方法對分離菌株進行了tet-R基因的檢測,發(fā)現(xiàn)養(yǎng)豬場樣品中的485株和養(yǎng)雞場樣品中289株TR-LFE攜帶有1種或1種以上的被檢測的tet-R基因。(3)養(yǎng)豬場分離的TR-LFE中10種tet-R基因的平均檢出率的順序tet(A) tet(B) tet(M) tet(G) tet(C) tet(D), tet(S) tet(O) tet(X)tet(E)。養(yǎng)雞場分離的TR-LFE中10tet-R基因的平均檢出率的大小順序為tet(A) tet(B) tet(M) tet(D) tet(G) tet(O) tet(C) tet(E), tet(S), tet(X)。外輸泵基因tet(A)、tet(B)和核糖體保護蛋白基因tet(M)是本研究中分離的TR-LFE菌株中最主要的tet-R基因。(4)養(yǎng)豬場分離的TR-LFE中,tet(A)+tet(B)、tet(A)+tet(M)和tet(B)+tet(M)是檢出率最高的雙重tet-R基因型；tet(A)+tet(M)和tet(A)+tet(B)是雞糞和堆肥中分離的TR-LFE菌株中雙重tet-R基因檢出率最高的類型。不同來源的TR-LFE中攜帶單重tet-R基因的檢出率順序為幼豬糞成豬糞土壤豬糞堆肥,多重tet-R基因的檢出率的大小順序為豬堆肥土壤成豬糞幼豬糞。豬糞堆肥中分離的TR-LFE不僅多重tet-R基因檢出率是最高的,而且多重耐藥基因的種類也是最多的。豬糞堆肥和雞糞堆肥中分離的TR-LFE中的單重tet-R基因的種類也最多。(5)養(yǎng)豬場各樣品抽提獲得的總DNA中tet-R基因的檢出率大小順序為成豬糞幼豬糞豬糞堆肥土壤；養(yǎng)雞場中各樣品抽提獲得的總DNA中tet-R基因的檢出率的大小順序為成雞糞幼雞糞雞糞堆肥。(6)采用熒光定量PCR方法對養(yǎng)豬場和養(yǎng)雞場樣品中所含的tet(A)和tet(C)基因的含量進行檢測,結果表明豬糞堆肥中tet(A)和tet(C)基因的含量比新鮮豬糞中的低0～3、1～4個數(shù)量級,土壤中的tet(A)和tet(C)的含量比豬糞堆肥中的均低0～1個數(shù)量級。雞糞堆肥中tet(A)和tet(C)的含量比新鮮糞便中的分別減少了0～4、1～3數(shù)量級。據(jù)此推測tet-R基因在糞便、堆肥和土壤中呈逐級降低的趨勢,堆肥過程可能有利于tet-R基因含量的降低。
【關鍵詞】：四環(huán)素耐藥基因 乳糖發(fā)酵性腸桿菌 禽畜糞便 堆肥 土壤 PCR 定量PCR
【學位授予單位】：華東師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：X713;X53
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 英文縮略詞表13-14
• 第1章 緒論14-32
• 1.1 抗生素簡介14-17
• 1.1.1 抗生素的定義14
• 1.1.2 抗生素的種類14-15
• 1.1.3 抗生素的作用機理15-16
• 1.1.4 環(huán)境中抗生素的來源16
• 1.1.5 國內外抗生素的使用情況16-17
• 1.2 四環(huán)素類抗生素簡介17-18
• 1.3 四環(huán)素耐藥基因18-20
• 1.3.1 四環(huán)素耐藥菌的耐藥機制18-19
• 1.3.2 四環(huán)素耐藥基因的來源19-20
• 1.4 環(huán)境中四環(huán)素耐藥基因的研究情況20-23
• 1.4.1 禽畜養(yǎng)殖中四環(huán)素耐藥基因20-21
• 1.4.2 土壤環(huán)境中的四環(huán)素耐藥基因21-22
• 1.4.3 水環(huán)境中的四環(huán)素耐藥基因22-23
• 1.5 四環(huán)素耐藥基因在環(huán)境中的傳播與擴散23-25
• 1.6 環(huán)境中四環(huán)素耐藥基因的去除25-28
• 1.6.1 污水處理廠對四環(huán)素耐藥基因的去除25-27
• 1.6.2 堆肥對四環(huán)素耐藥基因的去除27-28
• 1.7 研究背景與意義28-29
• 1.8 研究內容與技術路線29-32
• 1.8.1 研究方法29-31
• 1.8.2 研究技術路線31-32
• 第2章 實驗材料與實驗方法32-40
• 2.1 樣品采集32
• 2.2 實驗材料32-33
• 2.2.1 實驗試劑32
• 2.2.2 實驗儀器32-33
• 2.3 定性PCR反應33-36
• 2.3.1 培養(yǎng)基配制33-34
• 2.3.2 細菌培養(yǎng)34
• 2.3.3 細胞全基因組DNA的提取34
• 2.3.4 PCR反應34-36
• 2.3.5 凝膠電泳實驗36
• 2.4 熒光定量PCR36-40
• 2.4.1 樣品中總DNA的提取與DNA濃度測定36
• 2.4.2 定性PCR36
• 2.4.3 標準品濃度36
• 2.4.4 熒光定量PCR反應36-37
• 2.4.5 標準曲線37-40
• 第3章 四環(huán)素耐藥基因在豬糞、豬糞堆肥和土壤中的歸趨40-61
• 3.1 養(yǎng)豬場各樣品中的耐四環(huán)素乳糖發(fā)酵型腸桿菌40-45
• 3.1.1 細菌總數(shù)40-41
• 3.1.2 乳糖發(fā)酵型腸桿菌總數(shù)41-42
• 3.1.3 耐四環(huán)素乳糖發(fā)酵型腸桿菌總數(shù)42-43
• 3.1.4 耐四環(huán)素乳糖發(fā)酵型腸桿菌所占的百分比43-45
• 3.2 養(yǎng)豬場樣品中TR-LFE中tet-R基因型的檢出情況45-54
• 3.2.1 攜帶所檢測的tet-R基因的TR-LFE總數(shù)45
• 3.2.2 TR-LFE中所檢測tet-R基因型統(tǒng)計45-50
• 3.2.3 不同季節(jié)各樣品中tet-R基因的檢出情況50-54
• 3.3 養(yǎng)豬場各樣品總DNA中tet-R基因檢出情況54-56
• 3.4 養(yǎng)豬場各樣品中tet-R基因的豐度56-59
• 3.4.1 養(yǎng)豬場各樣品中tet(A)的含量56-58
• 3.4.2 養(yǎng)豬場各樣品中tet(C)的含量58-59
• 3.5 本章小結59-61
• 第4章 四環(huán)素耐藥基因在雞糞、雞糞堆肥中的歸趨61-76
• 4.1 養(yǎng)雞場各樣品中耐四環(huán)素乳糖發(fā)酵型腸桿菌61-64
• 4.1.1 細菌總數(shù)61-62
• 4.1.2 乳糖發(fā)酵型腸桿菌總數(shù)62
• 4.1.3 耐四環(huán)素乳糖發(fā)酵型腸桿菌總數(shù)62-63
• 4.1.4 耐四環(huán)素乳糖發(fā)酵型腸桿菌所占的百分比63-64
• 4.2 養(yǎng)雞場中TR-LFE中tet-R基因型分析64-71
• 4.2.1 攜帶所檢測tet-R基因的TR-LFE總數(shù)64-65
• 4.2.2 TR-LFE中tet-R基因型統(tǒng)計65-68
• 4.2.3 不同季節(jié)各樣品中tet-R基因的檢出情況68-71
• 4.3 養(yǎng)雞場各樣品中總DNA中tet-R基因檢出情況71-72
• 4.4 養(yǎng)雞場各樣品中tet-R基因的豐度72-75
• 4.4.1 養(yǎng)雞場各樣品中tet(A)的含量72-73
• 4.4.2 養(yǎng)雞場各樣品中tet(C)的含量73-75
• 4.5 本章小結75-76
• 第5章 總結與展望76-78
• 5.1 總結76-77
• 5.2 展望與建議77-78
• 附錄1 tet-R基因擴增圖譜78-82
• 附錄2 各樣品TR-LFE中的tet-R基因82-93
• 參考文獻93-98
• 致謝98

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