蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,簡稱Bt)是目前世界上應(yīng)用最廣泛、環(huán)保的生物殺蟲劑。營養(yǎng)期殺蟲蛋白(Vegetative Insecticidal Protein,VIP)是繼殺蟲晶體蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)后發(fā)現(xiàn)的具有顯著代表性的一類新型殺蟲蛋白。Vip3Aa蛋白是營養(yǎng)期殺蟲蛋白中研究最為普遍的蛋白,這類蛋白的氨基酸序列同源性很高,并且對鱗翅目昆蟲具有很高的殺蟲活性。但是不同Bt來源的ViP3Aa蛋白的殺蟲譜和殺蟲活性有所不同。Vip3Aa11和Vip3Aa39分別從Bt菌株C9和T03B001中分離得到,這兩種蛋白存在39個氨基酸差異位點(diǎn),氨基酸序列相似性較高,為95.06%。但是他們對某些鱗翅目昆蟲表現(xiàn)出的不同殺蟲活性。例如這兩種蛋白對鱗翅目昆蟲小地老虎(Agrotis ipsilon)的殺蟲活性存在一定差異,LC50分別為 73.62 μg/mL(43.20～115.03)和5.43 μg/mL(2.34～11.19)。為了探究這兩種蛋白對同一種昆蟲產(chǎn)生殺蟲活性差異的原因,本研究以小地老虎為靶標(biāo)對...

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【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
英文摘要
1 前言
    1.1 蘇云金芽胞桿菌
    1.2 蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白
        1.2.1 殺蟲晶體蛋白的分類及殺蟲活性
        1.2.2 殺蟲晶體蛋白的結(jié)構(gòu)與功能
        1.2.3 殺蟲晶體蛋白的應(yīng)用與面臨的問題
    1.3 蘇云金芽胞桿菌營養(yǎng)期殺蟲蛋白
        1.3.1 營養(yǎng)期殺蟲蛋白Vip1A/Vip2A二元毒素
        1.3.2 營養(yǎng)期殺蟲蛋白Vip3A
    1.4 營養(yǎng)期殺蟲蛋白Vip3A應(yīng)用
        1.4.1 構(gòu)建Bt工程菌
        1.4.2 Vip3A在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用
    1.5 小地老虎
        1.5.1 小地老虎的分類地位及其危害
        1.5.2 小地老虎的主要防治措施及其存在的問題
    1.6 高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在昆蟲上的應(yīng)用
        1.6.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究
        1.6.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究手段
        1.6.3 昆蟲轉(zhuǎn)錄組學(xué)
    1.7 本研究的目的與意義
2 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株與質(zhì)粒
        2.1.2 試劑
        2.1.3 儀器設(shè)備
        2.1.4 供試?yán)ハx
    2.2 研究方法
        2.2.1 vip3Aa基因的克隆
        2.2.2 基因擴(kuò)增引物
        2.2.3 DNA回收
        2.2.4 E.coli感受態(tài)細(xì)胞制備
        2.2.5 酶切反應(yīng)
        2.2.6 連接反應(yīng)
        2.2.7 大腸桿菌熱激轉(zhuǎn)化
        2.2.8 E.coli質(zhì)粒DNA提取
        2.2.9 vip3Aa基因在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)
        2.2.10 Vip3Aa蛋白的純化
        2.2.11 純化蛋白的生物素標(biāo)記
        2.2.12 蛋白質(zhì)的電泳檢測
        2.2.13 用于轉(zhuǎn)錄組測序試蟲的飼喂處理
        2.2.14 小地老虎中腸組織的提取
        2.2.15 RNA的提取與檢測
        2.2.16 cDNA合成
        2.2.17 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)過濾及De novo組裝
        2.2.18 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)功能注釋
        2.2.19 差異表達(dá)基因的檢測及聚類分析
        2.2.20 差異表達(dá)基因的GO功能分析及Pathway功能分析
        2.2.21 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗證
        2.2.22 供試?yán)ハx中腸組織BBMV的提取
        2.2.23 結(jié)合及競爭結(jié)合實驗
        2.2.24 Ligand blot實驗
3 結(jié)果與分析
    3.1 小地老虎中腸轉(zhuǎn)錄組測序
        3.1.1 vip3Aa基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.1.2 Vip3Aa蛋白的表達(dá)及純化
        3.1.3 供試?yán)ハx中腸RNA樣品的提取及質(zhì)量檢測
        3.1.4 轉(zhuǎn)錄組測序及序列組裝
        3.1.5 Unigene功能注釋
        3.1.6 維恩圖分析
        3.1.7 Unigene的CDS和TF編碼能力預(yù)測及SSR和SNP檢測
    3.2 差異表達(dá)基因分析
        3.2.1 差異表達(dá)基因的檢測
        3.2.2 差異表達(dá)基因的統(tǒng)計分析
        3.2.3 差異表達(dá)基因的聚類分析
        3.2.4 差異表達(dá)基因的GO功能分析
        3.2.5 差異表達(dá)基因的Pathway功能分析
        3.2.6 qRT-PCR驗證
    3.3 小地老虎中腸對Vip3Aa應(yīng)答相關(guān)基因的鑒定
        3.3.1 差異表達(dá)基因中與免疫相關(guān)的基因的鑒定
        3.3.2 差異表達(dá)基因中與代謝相關(guān)的基因的鑒定
        3.3.3 差異表達(dá)基因中Bt毒素潛在受體蛋白基因的鑒定
        3.3.4 差異表達(dá)基因中與消化作用相關(guān)基因的鑒定
    3.4 Vip3Aa11蛋白與Vip3Aa39蛋白殺蟲活性差異分析
        3.4.1 Vip3Aa11與Vip3Aa39蛋白的胰蛋白酶消化
        3.4.2 Vip3Aa11與Vip3Aa39蛋白與供試?yán)ハx中腸BBMV的體外結(jié)合
4 討論
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號：3898155