蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,簡(jiǎn)稱(chēng)Bt)是目前世界上應(yīng)用最廣泛、環(huán)保的生物殺蟲(chóng)劑。營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白(Vegetative Insecticidal Protein,VIP)是繼殺蟲(chóng)晶體蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)后發(fā)現(xiàn)的具有顯著代表性的一類(lèi)新型殺蟲(chóng)蛋白。Vip3Aa蛋白是營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白中研究最為普遍的蛋白,這類(lèi)蛋白的氨基酸序列同源性很高,并且對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)具有很高的殺蟲(chóng)活性。但是不同Bt來(lái)源的ViP3Aa蛋白的殺蟲(chóng)譜和殺蟲(chóng)活性有所不同。Vip3Aa11和Vip3Aa39分別從Bt菌株C9和T03B001中分離得到,這兩種蛋白存在39個(gè)氨基酸差異位點(diǎn),氨基酸序列相似性較高,為95.06%。但是他們對(duì)某些鱗翅目昆蟲(chóng)表現(xiàn)出的不同殺蟲(chóng)活性。例如這兩種蛋白對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)小地老虎(Agrotis ipsilon)的殺蟲(chóng)活性存在一定差異,LC50分別為 73.62 μg/mL(43.20～115.03)和5.43 μg/mL(2.34～11.19)。為了探究這兩種蛋白對(duì)同一種昆蟲(chóng)產(chǎn)生殺蟲(chóng)活性差異的原因,本研究以小地老虎為靶標(biāo)對(duì)...

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
英文摘要
1 前言
    1.1 蘇云金芽胞桿菌
    1.2 蘇云金芽胞桿菌殺蟲(chóng)晶體蛋白
        1.2.1 殺蟲(chóng)晶體蛋白的分類(lèi)及殺蟲(chóng)活性
        1.2.2 殺蟲(chóng)晶體蛋白的結(jié)構(gòu)與功能
        1.2.3 殺蟲(chóng)晶體蛋白的應(yīng)用與面臨的問(wèn)題
    1.3 蘇云金芽胞桿菌營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白
        1.3.1 營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白Vip1A/Vip2A二元毒素
        1.3.2 營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白Vip3A
    1.4 營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白Vip3A應(yīng)用
        1.4.1 構(gòu)建Bt工程菌
        1.4.2 Vip3A在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用
    1.5 小地老虎
        1.5.1 小地老虎的分類(lèi)地位及其危害
        1.5.2 小地老虎的主要防治措施及其存在的問(wèn)題
    1.6 高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在昆蟲(chóng)上的應(yīng)用
        1.6.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究
        1.6.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究手段
        1.6.3 昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)
    1.7 本研究的目的與意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株與質(zhì)粒
        2.1.2 試劑
        2.1.3 儀器設(shè)備
        2.1.4 供試?yán)ハx(chóng)
    2.2 研究方法
        2.2.1 vip3Aa基因的克隆
        2.2.2 基因擴(kuò)增引物
        2.2.3 DNA回收
        2.2.4 E.coli感受態(tài)細(xì)胞制備
        2.2.5 酶切反應(yīng)
        2.2.6 連接反應(yīng)
        2.2.7 大腸桿菌熱激轉(zhuǎn)化
        2.2.8 E.coli質(zhì)粒DNA提取
        2.2.9 vip3Aa基因在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)
        2.2.10 Vip3Aa蛋白的純化
        2.2.11 純化蛋白的生物素標(biāo)記
        2.2.12 蛋白質(zhì)的電泳檢測(cè)
        2.2.13 用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序試蟲(chóng)的飼喂處理
        2.2.14 小地老虎中腸組織的提取
        2.2.15 RNA的提取與檢測(cè)
        2.2.16 cDNA合成
        2.2.17 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)過(guò)濾及De novo組裝
        2.2.18 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)功能注釋
        2.2.19 差異表達(dá)基因的檢測(cè)及聚類(lèi)分析
        2.2.20 差異表達(dá)基因的GO功能分析及Pathway功能分析
        2.2.21 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證
        2.2.22 供試?yán)ハx(chóng)中腸組織BBMV的提取
        2.2.23 結(jié)合及競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)
        2.2.24 Ligand blot實(shí)驗(yàn)
3 結(jié)果與分析
    3.1 小地老虎中腸轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
        3.1.1 vip3Aa基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.1.2 Vip3Aa蛋白的表達(dá)及純化
        3.1.3 供試?yán)ハx(chóng)中腸RNA樣品的提取及質(zhì)量檢測(cè)
        3.1.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及序列組裝
        3.1.5 Unigene功能注釋
        3.1.6 維恩圖分析
        3.1.7 Unigene的CDS和TF編碼能力預(yù)測(cè)及SSR和SNP檢測(cè)
    3.2 差異表達(dá)基因分析
        3.2.1 差異表達(dá)基因的檢測(cè)
        3.2.2 差異表達(dá)基因的統(tǒng)計(jì)分析
        3.2.3 差異表達(dá)基因的聚類(lèi)分析
        3.2.4 差異表達(dá)基因的GO功能分析
        3.2.5 差異表達(dá)基因的Pathway功能分析
        3.2.6 qRT-PCR驗(yàn)證
    3.3 小地老虎中腸對(duì)Vip3Aa應(yīng)答相關(guān)基因的鑒定
        3.3.1 差異表達(dá)基因中與免疫相關(guān)的基因的鑒定
        3.3.2 差異表達(dá)基因中與代謝相關(guān)的基因的鑒定
        3.3.3 差異表達(dá)基因中Bt毒素潛在受體蛋白基因的鑒定
        3.3.4 差異表達(dá)基因中與消化作用相關(guān)基因的鑒定
    3.4 Vip3Aa11蛋白與Vip3Aa39蛋白殺蟲(chóng)活性差異分析
        3.4.1 Vip3Aa11與Vip3Aa39蛋白的胰蛋白酶消化
        3.4.2 Vip3Aa11與Vip3Aa39蛋白與供試?yán)ハx(chóng)中腸BBMV的體外結(jié)合
4 討論
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號(hào)：3898155