基因沉默是真核生物中相對(duì)保守的機(jī)制之一。赤擬谷盜具有非常敏感的基因沉默效應(yīng)。但是對(duì)于dsRNA的吸收機(jī)制尚不清楚。本研究利用內(nèi)吞作用抑制劑并結(jié)合基因沉默技術(shù)(RANi)來研究赤擬谷盜dsRNA的吸收機(jī)制。結(jié)果表明網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用抑制劑氯丙嗪和巴佛洛霉素A可以有效阻止赤擬谷盜細(xì)胞吸收dsRNA進(jìn)而影響其靶標(biāo)基因沉默效率,同時(shí)赤擬谷盜中腸組織切片也顯示應(yīng)用以上兩種內(nèi)吞作用抑制劑后,中腸細(xì)胞中沒有釋放Cy3熒光信號(hào),該結(jié)果更為直觀的證明了氯丙嗪和巴佛洛霉素A可以阻止細(xì)胞吸收dsRNA。上述結(jié)果初步證實(shí)了網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用參與dsRNA的吸收過程,因此我們從該途徑中選取了4個(gè)相對(duì)重要的蛋白,即銜接蛋白2中的μ鏈(TcAP50)、網(wǎng)格蛋白重鏈(TcChc)、V型ATP酶H亞基(TcVhaSFD)和Rab7(TcRab7)。利用基因沉默技術(shù)將以上參與蛋白分別沉默后發(fā)現(xiàn),標(biāo)靶基因的沉默效率顯著降低。以上研究結(jié)果表明網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用參與赤擬谷盜dsRNA的吸收過程。 幼蟲巨大致死基因(lethal giant larvae)作為腫瘤抑制基因在上皮細(xì)胞極化過程中起著非常重要的作用。本研究...

【文章頁數(shù)】：128 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 基因沉默(RNAi)簡(jiǎn)介
        1.1 RNAi的發(fā)現(xiàn)與發(fā)展
        1.2 RNAi的作用機(jī)制及特點(diǎn)
        1.3 RNAi的分類
        1.4 RNAi在昆蟲學(xué)上應(yīng)用
        1.5 植物傳遞的RNAi效應(yīng)與害蟲治理
        1.6 dsRNA的吸收機(jī)制
    2 幼蟲巨大致死基因(Lethal giant larvae(Lgl))
    3 內(nèi)吞作用(Endocytosis)
        3.1 內(nèi)吞作用的機(jī)制
        3.2 內(nèi)吞作用的分類
        3.3 網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(Clathrin-mediated endocytosis)
    4 本論文的研究意義
第二章 赤擬谷盜幼蟲巨大致死基因(Lgl)的分子特性
    1 材料與方法
        1.1 供試蟲源及飼養(yǎng)
        1.2 試劑與試劑盒
        1.3 試劑的配制
        1.4 主要儀器
        1.5 引物設(shè)計(jì)
        1.6 總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成
        1.7 PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物回收純化、連接及轉(zhuǎn)化
        1.8 克隆PCR和質(zhì)粒提取
    2 結(jié)果與分析
        2.1 總RNA的提取
        2.2 擴(kuò)增目的條帶
        2.3 赤擬谷盜TcLgl的cDNA序列及推導(dǎo)的蛋白序列
        2.4 赤擬谷盜TcLgl的基因組結(jié)構(gòu)
        2.5 幾種昆蟲Lgl的氨基酸序列比對(duì)
        2.6 昆蟲Lgl的遺傳發(fā)育樹分析
    3 討論
第三章 赤擬谷盜Lgl基因的表達(dá)量分析
    1 材料與方法
        1.1 供試蟲源及飼養(yǎng)
        1.2 主要試劑
        1.3 主要儀器
        1.4 總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成
        1.5 熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)
        1.6 不同發(fā)育時(shí)期、不同組織TcLgl基因表達(dá)量測(cè)定(RT-qPCR)
    2 結(jié)果與分析
        2.1 不同發(fā)育時(shí)期、不同組織TcLgl的相對(duì)表達(dá)量
    3 討論
第四章 赤擬谷盜Lgl基因的功能研究
    1 材料與方法
        1.1 供試蟲源及飼養(yǎng)
        1.2 主要儀器
        1.3 主要試劑
        1.4 含T7啟動(dòng)子的模板DNA制備
        1.5 dsRNA的制備
        1.6 顯微注射及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
        1.7 mRNA水平檢測(cè)沉默效率
    2 結(jié)果與分析
        2.1 dsRNA的合成
        2.2 dsRNA介導(dǎo)的TcLgl沉默對(duì)早期幼蟲存活率的影響
        2.3 dsRNA介導(dǎo)的TcLgl沉默對(duì)末齡幼蟲化蛹率的影響
        2.4 dsRNA介導(dǎo)的TcLgl沉默對(duì)早期蛹羽化率的影響
    3 討論
第五章 赤擬谷盜內(nèi)吞作用相關(guān)基因的分子特性
    1 材料與方法
        1.1 供試蟲源及飼養(yǎng)
        1.2 試劑與試劑盒
        1.3 試劑的配制
        1.4 主要儀器
        1.5 引物設(shè)計(jì)
        1.6 總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成
        1.7 PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物回收純化、連接及轉(zhuǎn)化
        1.8 克隆PCR和質(zhì)粒提取
    2 結(jié)果與分析
        2.1 赤擬谷盜網(wǎng)格蛋白重鏈基因(TcChc)
        2.2 赤擬谷盜銜接蛋白基因(TcAP50)
        2.3 赤擬谷盜V型ATP酶亞基H基因(TcVhaSFD)
        2.4 赤擬谷盜Rab7
    3 討論
第六章 赤擬谷盜內(nèi)吞作用相關(guān)基因表達(dá)量分析
    1 材料與方法
        1.1 供試蟲源及飼養(yǎng)
        1.2 主要試劑
        1.3 主要儀器
        1.4 總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成
        1.5 熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)
        1.6 不同發(fā)育時(shí)期、不同組織內(nèi)吞作用相關(guān)基因表達(dá)量測(cè)定(RT-qPCR)
    2 結(jié)果
        2.1 不同發(fā)育時(shí)期、不同組織TcChc基因相對(duì)表達(dá)量
        2.2 不同發(fā)育時(shí)期、不同組織TcAP50基因相對(duì)表達(dá)量
        2.3 不同發(fā)育時(shí)期、不同組織TcVhaSFD基因相對(duì)表達(dá)量
        2.4 不同發(fā)育時(shí)期、不同組織TcRab7基因表達(dá)量
    3 討論
第七章 赤擬谷盜內(nèi)吞作用相關(guān)基因的功能研究
    1 材料與方法
        1.1 供試蟲源及飼養(yǎng)
        1.2 主要儀器
        1.3 主要試劑
        1.4 含T7啟動(dòng)子的模板DNA制備
        1.5 dsRNA的制備
        1.6 顯微注射及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
        1.7 mRNA水平檢測(cè)沉默效率
        1.8 赤擬谷盜卵巢組織的解剖與染色
    2 結(jié)果與分析
        2.1 赤擬谷盜網(wǎng)格蛋白重鏈基因的功能
        2.2 赤擬谷盜AP50基因的功能
        2.3 赤擬谷盜VhaSFD基因的功能
        2.4 赤擬谷盜Rab7基因的功能
    3 討論
第八章 赤擬谷盜dsRNA吸收機(jī)制的藥理學(xué)研究
    1 材料與方法
        1.1 供試蟲源及飼養(yǎng)
        1.2 主要試劑
        1.3 主要儀器
        1.4 總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成
        1.5 熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)
    2 結(jié)果與分析
        2.1 氯丙嗪(Chlorpromazine)
        2.2 甲基-β-環(huán)糊精(Methyl-β-cyclodextrin)
        2.3 巴佛洛霉素A(Bafilomycin A1)
        2.4 細(xì)胞松弛素D(Cytochalasin D)
    3 討論
第九章 赤擬谷盜dsRNA吸收機(jī)制的熒光定位分析
    1 材料與方法
        1.1 供試蟲源及飼養(yǎng)
        1.2 主要儀器
        1.3 主要試劑
        1.4 Cy3標(biāo)記dsRNA制備
        1.5 赤擬谷盜中腸組織切片制作
    2 結(jié)果與分析
        2.1 Cy3標(biāo)記dsRNA的合成
        2.2 赤擬谷盜中腸組織切片
    3 討論
第十章 赤擬谷盜dsRNA吸收的分子機(jī)制
    1 材料與方法
        1.1 供試蟲源及飼養(yǎng)
        1.2 主要儀器
        1.3 主要試劑
        1.4 含T7啟動(dòng)子的模板DNA制備
        1.5 dsRNA的制備
        1.6 顯微注射及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
        1.7 mRNA水平檢測(cè)沉默效率
    2 結(jié)果與分析
        2.1 不同長(zhǎng)度dsRNA的合成
        2.2 不同長(zhǎng)度dsRNA對(duì)靶標(biāo)基因沉默效率的影響
        2.3 網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用對(duì)靶標(biāo)基因沉默效率的影響
        2.4 赤擬谷盜dsRNA的吸收機(jī)制
    3 討論
全文總結(jié)與展望
    1 總結(jié)
    2 本研究創(chuàng)新之處
    3 問題與展望
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄Ⅰ 本論文所用引物列表
附錄Ⅱ 本論文克隆的所有基因序列
作者簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：3843552