橘小實蠅是一種危險性的果蔬害蟲,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的迅猛發(fā)展為農(nóng)業(yè)害蟲的科學(xué)防治帶來了新的發(fā)展契機。本研究以橘小實蠅生殖發(fā)育相關(guān)的三個目標(biāo)基因(boule、rhomboid、sex peptide receptor)為對象,利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)研究其功能,探討CRISPR/Cas9在橘小實蠅研究中的可行性,比較這些基因編輯敲除后對橘小實蠅生殖功能的影響,篩選為未來建立橘小實蠅遺傳防控,特別是基于CRISPR/Cas9基因編輯的綠色防控技術(shù)提供靶基因。研究結(jié)果如下:1.克隆獲得Bdbol基因,發(fā)現(xiàn)其在精巢表達量最高,顯著性高于卵巢的表達量。篩選得到了兩個高活性sgRNA(B-sg2、B-sg5)用于CRISPR/Cas9基因敲除。在突變品系G0中有64.70%的個體發(fā)生了基因突變,其中突變個體的平均嵌合率達到了63.42%。突變體Bdbol^-雄蟲回交后代G1的胚胎孵化率出現(xiàn)了顯著的降低(Student’s t-test,P<0.05),甚至于完全不孵化。精子活力檢測發(fā)現(xiàn)Bdbol^-

【文章頁數(shù)】：101 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻綜述
    1 橘小實蠅概述
    2 boule基因
    3 rhomboid基因
    4 spr(sex peptide receptor)基因
    5 CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)
        5.1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)及原理
        5.2 CRISPR/Cas9 技術(shù)方法及優(yōu)缺點
        5.3 CRISPR/Cas9 技術(shù)在昆蟲中的應(yīng)用
    6 研究內(nèi)容與目的意義
        6.1 本研究的內(nèi)容與目的意義
        6.2 技術(shù)路線
第二章 材料與方法
    1 實驗材料
    2 實驗方法
第三章 結(jié)果與分析
    1 目的基因的克隆與分析
        1.1 Bdbol基因序列分析
            1.1.1 Bdbol基因克隆
            1.1.2 Bdbol基因系統(tǒng)進化樹
            1.1.3 Bdbol基因蛋白序列比對分析
        1.2 Bdbol基因時空表達模式分析
        1.3 Bdrho基因序列分析
            1.3.1 Bdrho基因克隆
            1.3.2 Bdrho基因系統(tǒng)進化樹
            1.3.3 Bdrho基因蛋白序列比對分析
        1.4 Bdrho基因時空表達模式分析
        1.5 Bdspr基因序列分析
            1.5.1 Bdspr基因克隆
            1.5.2 Bdspr基因系統(tǒng)進化樹
            1.5.3 Bdspr基因蛋白序列比對分析
        1.6 Bdspr基因時空表達模式分析
    2 突變品系的建立
        2.1 sgRNA的設(shè)計與篩選
            2.1.1 目的基因靶標(biāo)位點設(shè)計
            2.1.2 體外合成獲得sgRNA
            2.1.3 sgRNA體外活性分析
        2.2 Cas9 mRNA合成及RNPs復(fù)合體制備
        2.3 胚胎顯微注射建立突變品系
    3 突變體基因型分析
        3.1 Bdbol基因敲除分析
            3.1.1 突變體片段刪除分析
            3.1.2 T7E1 酶切分析
            3.1.3 分子克隆分析
        3.2 Bdrho基因敲除分析
            3.2.1 突變體片段刪除分析
            3.2.2 T7E1 酶切分析
            3.2.3 分子克隆分析
        3.3 Bdspr基因敲除分析
            3.3.1 突變體片段刪除分析
            3.3.2 T7E1 酶切分析
            3.3.3 分子克隆分析
        3.4 脫靶效應(yīng)分析
        3.5 靶基因突變效應(yīng)比較
    4 目的基因敲除對生殖的影響
        4.1 對橘小實蠅生殖能力的影響
            4.1.1 Bdbol^-對生殖能力的影響
            4.1.2 Bdrho^-對生殖能力的影響
            4.1.3 Bdspr^-對生殖能力的影響
            4.1.4 靶基因突變體生殖能力比較
        4.2 對橘小實蠅生殖系統(tǒng)發(fā)育的影響
            4.2.1 Bdbol^-對生殖系統(tǒng)發(fā)育的影響
            4.2.2 Bdrho^-對生殖系統(tǒng)發(fā)育的影響
            4.2.3 Bdspr^-對生殖系統(tǒng)發(fā)育的影響
    5 小結(jié)與討論
第四章 總結(jié)與展望
    1 總結(jié)
    2 創(chuàng)新點
    3 展望
參考文獻
攻讀學(xué)位期間已發(fā)表論文
致謝



本文編號：3842541