化學(xué)農(nóng)藥和化肥的過度使用已經(jīng)對環(huán)境和食品安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。開發(fā)利用環(huán)境友好的有益微生物進(jìn)行植物病害生物防治作為化學(xué)防治的替代或補(bǔ)充,有利于農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展、維護(hù)生態(tài)平衡和保障食品安全性。但是生防微生物也存在抗菌譜狹窄、生防活性不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。因此篩選新的靶標(biāo)基因構(gòu)建具有高效和穩(wěn)定生防活性的工程菌株具有重要的理論價(jià)值和應(yīng)用前景。GGDEF/EAL結(jié)構(gòu)域蛋白在細(xì)菌中廣泛存在,大量研究已表明它們參與調(diào)控細(xì)菌運(yùn)動性、生物膜形成、致病性、細(xì)胞分化和增殖等多種生命活動。然而,在植病生防菌中GGDEF/EAL結(jié)構(gòu)域蛋白的相關(guān)研究至今尚未見報(bào)道。普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica) G3是分離自小麥內(nèi)莖的內(nèi)生菌,能夠產(chǎn)生多種抗真菌因子如蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、硝吡咯菌素(pyrrolnitrin, PRN),以及植物促生物質(zhì)吲哚乙酸IAA與乙偶姻,因而具有一定的生防和促生潛能。前期研究已表明QS系統(tǒng)、Rsm系統(tǒng)、Hfq和RpoS等全局調(diào)控因子參與調(diào)控G3菌株的生防活性。通過分析S. plymuthica G3基因組序列鑒定了一個(gè)編碼GGDEF/EAL結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的基因pigX,但是功能未知。本...

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【學(xué)位級別】：博士

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摘要
Abstract
縮寫與符號
第一章 前言
    1.1 內(nèi)生菌及其生物防治
        1.1.1 內(nèi)生菌的作用
        1.1.2 內(nèi)生菌生防活性的調(diào)控
    1.2 細(xì)菌GGDEF/EAL結(jié)構(gòu)域蛋白
        1.2.1 二鳥苷酸環(huán)化酶(DGC)
        1.2.2 磷酸二酯酶(PDE)
        1.2.3 含GGDEF/EAL結(jié)構(gòu)域的c-di-GMP效應(yīng)蛋白
        1.2.4 CsrD家族蛋白
        1.2.5 c-di-GMP的功能
        1.2.6 c-di-GMP的信號通路與其他調(diào)控系統(tǒng)的相互作用
    1.3 普城沙雷氏菌與生物防治
    1.4 研究目的、主要內(nèi)容和技術(shù)路線
        1.4.1 研究目的與意義
        1.4.2 主要研究內(nèi)容
        1.4.3 主要技術(shù)路線
第二章 S.plymuthica pigX突變體構(gòu)建及表型鑒定
    2.1 材料與儀器
        2.1.1 菌株、質(zhì)粒、引物和培養(yǎng)基
        2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.3 主要試劑
    2.2 方法
        2.2.1 pigX基因的克隆和生物信息學(xué)分析
        2.2.2 pigX自殺性載體的構(gòu)建
        2.2.3 pigX::Gm突變體的篩選
        2.2.4 pigX::Gm突變體互補(bǔ)菌株的構(gòu)建
        2.2.5 蛋白酶活性和幾丁質(zhì)酶活性檢測
        2.2.6 運(yùn)動性檢測
        2.2.7 生物膜形成(biofilm formation)
        2.2.8 AHLs信號分子檢測
        2.2.9 真菌對峙實(shí)驗(yàn)
        2.2.10 PRN的提取和TLC檢測
        2.2.11 IAA檢測
        2.2.12 普里斯考爾試驗(yàn)(Voges Proskauer test,VP)檢測乙偶姻
        2.2.13 pigX::Gm/pUCP26-csrD的構(gòu)建及表型檢測
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 pigX克隆和生物信息學(xué)分析
        2.3.2 突變體pigX::Gm的構(gòu)建和驗(yàn)證
        2.3.3 突變體pigX::Gm互補(bǔ)菌株pigX::Gm/pUCP26-pigX的構(gòu)建
        2.3.4 PigX正調(diào)節(jié)蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的活性
        2.3.5 PigX正調(diào)控swimming和swarming運(yùn)動
        2.3.6 PigX負(fù)調(diào)控生物膜的形成
        2.3.7 PigX對AHLs信號分子合成的影響
        2.3.8 PigX正調(diào)控抑菌性和抗生素PRN生物合成
        2.3.9 PigX負(fù)調(diào)控IAA的合成
        2.3.10 PigX負(fù)調(diào)控乙偶姻的合成
        2.3.11 E.coli CsrD能夠部分恢復(fù)突變體pigX：：Gm的活性
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 轉(zhuǎn)錄或翻譯融合分析PigX的調(diào)控作用
    3.1 材料與儀器
    3.2 方法
        3.2.1 構(gòu)建△lacZ突變體
        3.2.2 構(gòu)建lux-、lacZ-的啟動子報(bào)告基因
        3.2.3 PigX對flhDC轉(zhuǎn)錄和翻譯的影響
        3.2.4 PigX對prnA轉(zhuǎn)錄和翻譯的影響
        3.2.5 PigX對splI和spsI轉(zhuǎn)錄的影響
        3.2.6 PigX與Rsm調(diào)控系統(tǒng)相互作用
        3.2.7. PigX與Hfq相互作用
        3.2.8 RpoS對pigX轉(zhuǎn)錄與翻譯的影響
        3.2.9 PigX自我調(diào)控
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 PigX正調(diào)控flhDC的表達(dá)
        3.3.2 PigX正調(diào)控prnABCD操縱子
        3.3.3 PigX正調(diào)控splI和spsI的轉(zhuǎn)錄
        3.3.4 PigX與Rsm調(diào)控系統(tǒng)相互作用
        3.3.5 PigX與Hfq的相互正調(diào)控
        3.3.6 RpoS負(fù)調(diào)控PigX
        3.3.7 PigX自我正調(diào)控
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 蛋白質(zhì)組學(xué)分析S.plymuthica G3 PigX的功能
    4.1 材料
        4.1.1 試劑與儀器
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.3 二維電泳相關(guān)試劑及其配制方法
    4.2 方法
        4.2.1 細(xì)菌全蛋白的提取
        4.2.2 蛋白質(zhì)濃度測定
        4.2.3 細(xì)菌全蛋白二維電泳
        4.2.4 蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜分析
        4.2.5 差異蛋白的生物信息學(xué)分析
        4.2.6 鞭毛蛋白的驗(yàn)證
        4.2.7 超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性測定
        4.2.8 翻譯融合驗(yàn)證LrhA蛋白
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 細(xì)菌總蛋白的差異蛋白表達(dá)譜分析
        4.3.2 差異蛋白的質(zhì)譜鑒定
        4.3.3 差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的生物信息學(xué)分析
        4.3.4 差異蛋白質(zhì)分析與討論
    4.4 小結(jié)
第五章 總結(jié)與展望
    總結(jié)
    展望
    創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
致謝
在讀期間發(fā)表的文章及參與的課題



本文編號：3814341