增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)起初在患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的血清中發(fā)現(xiàn),之后在其他物種(如哺乳動(dòng)物,果蠅等)中也發(fā)現(xiàn)了它的存在。由于PCNA蛋白結(jié)構(gòu)在進(jìn)化上的保守性,使得病毒和原核細(xì)胞中也具有類似PCNA的DNA聚合酶輔助因子。在不同進(jìn)化水平的生物中,它們具有相同的二級(jí)結(jié)構(gòu)單位—?螺旋和?折疊,和相似的三級(jí)結(jié)構(gòu)(一個(gè)可以在DNA鏈上滑動(dòng)的環(huán)形滑動(dòng)夾)。哺乳動(dòng)物的PCNA以同源三聚體的形式存在于細(xì)胞核,是DNA合成不可或缺的因子,它的表達(dá)水平與細(xì)胞周期的變化同步。在桿狀病毒苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa california multiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)中鑒定有與編碼增殖細(xì)胞核抗原蛋白序列同源的基因pcna,又稱AcOrf-49,全長771 bp,但是在DNA復(fù)制中的作用還不明確。在桿狀病毒的長期進(jìn)化過程中,其基因組中的某些基因會(huì)發(fā)生高頻率的缺失和獲得。其中,AcMNPV的pcna基因(Ac-pcna)就是由其宿主Sf9(Spodoptera fr...

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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中文摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 桿狀病毒
        1.1.1 桿狀病毒概述
        1.1.2 桿狀病毒分類地位
        1.1.3 桿狀病毒發(fā)育循環(huán)
        1.1.4 桿狀病毒病毒粒子相關(guān)蛋白分類
        1.1.5 昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)
    1.2 桿狀病毒基因組DNA復(fù)制和基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)基因
        1.2.1 桿狀病毒DNA復(fù)制原點(diǎn)hr
        1.2.2 桿狀病毒基因表達(dá)調(diào)控的級(jí)聯(lián)模型
        1.2.3 早期表達(dá)調(diào)節(jié)基因:ie2
    1.3 增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)
        1.3.1 增殖細(xì)胞核抗原的發(fā)現(xiàn)與結(jié)構(gòu)特征
        1.3.2 增殖細(xì)胞核抗原的生物學(xué)功能
        1.3.3 AcMNPV和Sf9細(xì)胞的增殖細(xì)胞核抗原
    1.4 反式轉(zhuǎn)錄因子P53
        1.4.1 病毒感染與宿主細(xì)胞凋亡
        1.4.2 宿主細(xì)胞凋亡與P53蛋白
    1.5 病毒感染與葡萄糖代謝
        1.5.1 病毒感染對(duì)細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)
        1.5.2 病毒感染對(duì)細(xì)胞葡萄糖代謝的調(diào)節(jié)
    1.6 昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)的新進(jìn)展
    1.7 論文的設(shè)計(jì)思路
        1.7.1 研究內(nèi)容與意義
        1.7.2 研究方法
        1.7.3 實(shí)驗(yàn)流程
        1.7.4 研究創(chuàng)新點(diǎn)
第二章 重組桿狀病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP的構(gòu)建與核蛋白Ac/Sf-PCNA-EGFP的表達(dá)分析
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器
        2.2.2 主要試劑及其配置
        2.2.3 細(xì)胞、病毒、菌株及載體
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 Ac/Sf-pcna的序列分析和其蛋白三維結(jié)構(gòu)同源建模
        2.3.2 昆蟲Sf9細(xì)胞的培養(yǎng)
        2.3.3 重組病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP的構(gòu)建
        2.3.4 蝕斑法測定重組病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP的滴度
        2.3.5 熒光顯微鏡觀察和Westernblot檢測Ac/Sf-PCNA-EGFP在AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9宿主細(xì)胞中的表達(dá)量
        2.3.6 Western blot檢測在AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9宿主細(xì)胞中Ac/Sf-pcna-EGFP在核內(nèi)的聚集情況
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.4.1 Ac/Sf-pcna的序列分析及其蛋白三維結(jié)構(gòu)模型
        2.4.2 重組病毒AcMNPV-Ac-pcna-EGFP的構(gòu)建
        2.4.3 重組病毒AcMNPV-Sf-pcna-EGFP的構(gòu)建
        2.4.4 AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9細(xì)胞中Ac/Sf-PCNA-EGFP的表達(dá)量分析
        2.4.5 AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9細(xì)胞中Ac/Sf-PCNA-EGFP在核內(nèi)聚集的分析
    2.5 討論
第三章 增殖細(xì)胞核抗原Ac/Sf-pcna的功能分析
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器
        3.2.2 主要試劑及其配制
        3.2.3 細(xì)胞、病毒、菌株、載體和蟲卵
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 絕對(duì)定量PCR檢測用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pUCm-T-hr3、pUCm-T-hsp90的構(gòu)建
        3.3.2 Sf9細(xì)胞的培養(yǎng)
        3.3.3 絕對(duì)定量PCR檢測在細(xì)胞內(nèi)及外分泌的重組病毒的基因組DNA的復(fù)制水平
        3.3.4 絕對(duì)定量PCR檢測重組病毒對(duì)Sf9基因組DNA復(fù)制的影響
        3.3.5 蝕斑實(shí)驗(yàn)檢測重組桿狀病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP對(duì)子代病毒增殖的影響
        3.3.6 Real-time PCR 檢測重組桿狀病毒Ac MNPV-Ac-pcna-EGFP對(duì)Ac MNPV晚期基因 38K、vp39轉(zhuǎn)錄水平的影響
        3.3.7 Real-time PCR檢測重組桿狀病毒Ac MNPV-Ac-pcna-EGFP對(duì)Ac MNPV極早期基因ie2轉(zhuǎn)錄水平的影響
        3.3.8 蟲試實(shí)驗(yàn)檢測重組桿狀病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP的抗蟲活性
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.4.1 絕對(duì)定量PCR檢測用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pUCm-T-hr3和pUCm-T-hsp90的構(gòu)建
        3.4.2 重組病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP對(duì)病毒基因組DNA復(fù)制的影響分析
        3.4.3 重組病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP對(duì)Sf9基因組DNA復(fù)制的影響分析
        3.4.4 重組病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP對(duì)子代病毒增殖的影響分析
        3.4.5 增殖細(xì)胞核抗原Ac-pcna對(duì)AcMNPV晚期基因38K、vp39以及極早期基因ie2轉(zhuǎn)錄水平的影響分析
        3.4.6 重組桿狀病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP的抗蟲效率分析
    3.5 討論
第四章 重組桿狀病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP對(duì)宿主Sf9細(xì)胞凋亡蛋白SfP53表達(dá)、葡萄糖代謝及外源蛋白表達(dá)的影響
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器
        4.2.2 主要試劑及其配置
        4.2.3 細(xì)胞、病毒
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 Sf9細(xì)胞的培養(yǎng)
        4.3.2 Western blot分析重組病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9細(xì)胞中SfP53的表達(dá)
        4.3.3 Western blot分析重組病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9細(xì)胞中核內(nèi)SfP53的積累
        4.3.4 重組病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9細(xì)胞中葡萄糖含量的分析
        4.3.5 Western blot分析不同感染復(fù)數(shù)的AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9細(xì)胞中外源蛋白R(shí)enilla Luciferase的表達(dá)
        4.3.6 Western blot分析在AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染Sf9細(xì)胞的過程中外源蛋白R(shí)enilla Luciferase的表達(dá)
    4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.4.1 重組病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9細(xì)胞中SfP53的表達(dá)量分析
        4.4.2 重組病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9細(xì)胞中核內(nèi)SfP53的積累分析
        4.4.3 重組病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9細(xì)胞中葡萄糖含量的分析
        4.4.4 不同感染復(fù)數(shù)的AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9細(xì)胞中外源蛋白R(shí)enilla Luciferase的表達(dá)量分析
        4.4.5 在AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染Sf9細(xì)胞的過程中外源蛋白R(shí)enilla Luciferase的表達(dá)量分析
    4.5 討論
總結(jié)與展望
參考文獻(xiàn)
附錄
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝
個(gè)人簡況及聯(lián)系方式



本文編號(hào)：3807744