昆蟲病原真菌是指寄生于昆蟲并引起昆蟲死亡的一類真菌,由于其對害蟲致病性強(qiáng)、在害蟲個體間傳播速度快、對環(huán)境友好性高等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的病蟲害防治。羅伯茨綠僵菌是一種廣譜殺蟲真菌,它的致病力強(qiáng),對農(nóng)作物無害且容易大規(guī)模生產(chǎn)。但是對于羅伯茨綠僵菌的遺傳改造一直受到其同源重組效率過低因素的限制。而以鋅指核酸酶和TALEN為代表的核酸內(nèi)切酶雖然可以達(dá)到進(jìn)行基因組編輯的目的,但其成本過高,操作流程復(fù)雜,難以達(dá)到對基因組進(jìn)行快速高效編輯的目的。CRISPR/Cas9是近年來興起的研究熱門,它具有操作簡單,成本低廉等特點(diǎn),使得高效編輯羅伯茨綠僵菌基因組成為一個可實現(xiàn)的目標(biāo)。本研究的目的是在羅伯茨綠僵菌中建立有效的CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng),將Cas9蛋白序列及sgRNA序列通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入羅伯茨綠僵菌中,并檢驗其編輯功能的效果,主要取得了以下幾點(diǎn)結(jié)果:(1)從與羅伯茨綠僵菌相近蟲生真菌構(gòu)建的CRISPR/Cas9系統(tǒng)文獻(xiàn)中得到Cas9蛋白基因序列,對Cas9蛋白基因序列進(jìn)行優(yōu)化,最后得到適合導(dǎo)入羅伯茨綠僵菌的Cas9蛋白基因序列;(2)分兩步先將Cas9蛋白的基因序列導(dǎo)入羅伯...

【文章頁數(shù)】：52 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 基因組編輯技術(shù)的概念及發(fā)展歷史
        1.1.1 基因編輯技術(shù)的概念
        1.1.2 ZFN基因組編輯技術(shù)
        1.1.3 TALEN基因組編輯技術(shù)
    1.2 CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)
        1.2.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理
        1.2.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的優(yōu)勢與不足
    1.3 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在絲狀真菌基因組編輯中的研究進(jìn)展
        1.3.1 絲狀真菌基因組編輯中的限制因素
        1.3.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在絲狀真菌基因組編輯中的應(yīng)用
    1.4 蟲生真菌中 CRISPR/Cas9 基因組編輯系統(tǒng)的研究現(xiàn)狀
    1.5 研究的目的和意義
2 實驗材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 供試菌株和載體
        2.1.2 主要化學(xué)試劑與生物試劑
        2.1.3 培養(yǎng)基配方及制作方法
        2.1.4 主要試劑配方
        2.1.5 實驗儀器及設(shè)備
    2.2 實驗方法
        2.2.1 菌株保藏方法
        2.2.2 PCR擴(kuò)增體系和條件
        2.2.3 DNA片段回收
        2.2.4 限制性內(nèi)切酶酶切體系
        2.2.5 T4DNALigase連接反應(yīng)體系
        2.2.6 AGL-1農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入質(zhì)粒
        2.2.7 綠僵菌DNA的提取
        2.2.8 綠僵菌RNA的提取
        2.2.9 綠僵菌 Cas9 蛋白印記檢測（Western Blot）
3 實驗結(jié)果
    3.1 兩步法構(gòu)建羅伯茨綠僵菌CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)
        3.1.1 Cas9蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.1.2 Cas9-bar質(zhì)粒導(dǎo)入羅伯茨綠僵菌
        3.1.3 Cas9序列表達(dá)驗證
        3.1.4 sgRNA表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.1.5 sgRNA-ben質(zhì)粒導(dǎo)入插入了Cas9序列的羅伯茨綠僵菌
        3.1.6 陽性轉(zhuǎn)化子與野生型的表型對照
    3.2 一步法構(gòu)建羅伯茨綠僵菌CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)
        3.2.1 Cas9-bar-gRNA-EGFP質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.2 EGFP-bar質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.3 Cas9-bar-gRNA-EGFP質(zhì)粒和EGFP-bar質(zhì)粒導(dǎo)入羅伯茨綠僵菌
        3.2.4 蛋白印記檢測驗證Cas9蛋白的存在
        3.2.5 陽性轉(zhuǎn)化子與空白對照的GFP蛋白表達(dá)驗證
4 討論
    4.1 Cas9蛋白及sgRNA的載體構(gòu)建
    4.2 蛋白印記檢測驗證Cas9蛋白的存在
    4.3 sgRNA啟動子的改進(jìn)
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
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