根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)(Meloidogyne spp.)為植物根系內(nèi)寄生物,可對(duì)農(nóng)作物造成嚴(yán)重的危害。在國(guó)內(nèi)已報(bào)道30多種根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)中,象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)(M. enterolobii Yang and Eisenback,1983)在海南島已普遍分布,廣東省也有發(fā)現(xiàn)。通過(guò)海南島瓜類(lèi)蔬菜、茄果類(lèi)蔬菜和南藥植物根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)種類(lèi)鑒定,發(fā)現(xiàn)該種群已進(jìn)一步擴(kuò)散,正在顯示出取代南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)Meloidogyne incognita,而成為我國(guó)熱帶亞熱帶地區(qū)最重要根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)種類(lèi)的趨勢(shì)。近年來(lái)對(duì)該線(xiàn)蟲(chóng)的研究備受關(guān)注,但對(duì)于其功能基因及功能基因組等分子生物學(xué)研究報(bào)道很少。本研究以該線(xiàn)蟲(chóng)為材料,在逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)結(jié)合cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)的基礎(chǔ)上,克隆得到M. enterolobii的Actin基因和Hsp70基因全長(zhǎng)cDNA序列,并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析以及MeHsp70原核表達(dá)分析。主要研究結(jié)果如下： (1) MeActin基因全長(zhǎng)cDNA序列為1298bp,包含一個(gè)全長(zhǎng)1125bp的開(kāi)放閱讀框ORF,編碼375個(gè)氨基酸,起始密碼子在82位,終止密碼子在1207位(GenBank登錄號(hào)K...

【文章頁(yè)數(shù)】：63 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
1 引言
    1.1 象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)研究進(jìn)展
    1.2 肌動(dòng)蛋白簡(jiǎn)介
    1.3 植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)Hsp70研究進(jìn)展
        1.3.1 Hsp70家族的分類(lèi)
        1.3.2 Hsp70的結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能
        1.3.3 植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)Hsp70的研究
        1.3.4 展望
    1.4 研究目的與意義
    1.5 研究的技術(shù)路線(xiàn)
2 材料與方法
    2.1 供試線(xiàn)蟲(chóng)
    2.2 主要試劑與儀器
    2.3 主要試劑及培養(yǎng)基配制
    2.4 象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)種群的純化與培養(yǎng)
        2.4.1 象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的鑒定
        2.4.2 象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的培養(yǎng)
        2.4.3 象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)J2的獲得
    2.5 總RNA的提取
        2.5.1 TRIzon提取法
        2.5.2 試劑盒提取法(動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒)
    2.6 cDNA的合成
        2.6.1 無(wú)RNase的DNase處理
        2.6.2 第一鏈cDNA的合成
    2.7 象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)Actin和Hsp70基因核心序列的克隆
        2.7.1 Hsp70簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)與合成
        2.7.2 象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)Actin基因中間片段的克隆
        2.7.3 象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)Hsp70基因中間片段的克隆
        2.7.4 目的片段的回收
        2.7.5 目的片段與T-載體的連接
        2.7.6 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
        2.7.7 陽(yáng)性克隆的鑒定
        2.7.8 重組質(zhì)粒的測(cè)序及分析
    2.8 RACE法獲得象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)Actin和Hsp70基因全長(zhǎng)cDNA
        2.8.1 3’和5’RACE cDNA第一鏈的合成
        2.8.2 象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)Actin和Hsp70基因3'RACE
        2.8.3 象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)Actin和Hsp70基因5'RACE
    2.9 象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)Actin cDNA和Hsp70 cDNA全長(zhǎng)序列的確定
    2.10 生物信息學(xué)分析
    2.11 象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)Hsp70的原核表達(dá)
        2.11.1 象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)Hsp70原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.11.2 Hsp70在BL21(DE3)中的誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白樣品的制備
        2.11.3 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳檢測(cè)
    2.12 轉(zhuǎn)化菌株的高溫脅迫處理
3 結(jié)果與分析
    3.1 象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的鑒定
    3.2 RNA的質(zhì)量分析
    3.3 象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)Actin和Hsp70基因的克隆與序列分析
        3.3.1 象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)Actin和Hsp70基因中間片段cDNA序列的克隆
        3.3.2 象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)Actin和Hsp70基因3'RACE克隆與序列分析
        3.3.3 象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)Actin和Hsp70基因5'RACE克隆與序列分析
        3.3.4 象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)Actin cDNA和Hsp70 cDNA全長(zhǎng)序列的確定
        3.3.5 象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)Actin和Hsp70序列分析和同源性比較
        3.3.6 象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)Actin和Hsp70進(jìn)化分析
        3.3.7 象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)Hsp70蛋白結(jié)構(gòu)和功能的預(yù)測(cè)
    3.4 pEASY-E1-MeHsp70、pET30-MeHsp70表達(dá)載體的構(gòu)建及目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.4.1 重組質(zhì)粒pEASY-E1-MeHsp70構(gòu)建結(jié)果
        3.4.2 重組質(zhì)粒pET30-MeHsp70的構(gòu)建結(jié)果
        3.4.3 重組質(zhì)粒pEASY-E1-MeHsp70、pET30a-MeHsp70轉(zhuǎn)化受體細(xì)菌轉(zhuǎn)化子的篩選
        3.4.4 Hsp70的表達(dá)
    3.5 異源表達(dá)Hsp70基因提高大腸桿菌的耐熱力
4 討論
    4.1 M. enterolobii Actin
    4.2 M. enterolobii Hsp70
5 結(jié)論
    5.1 M. enterolobii Actin
    5.2 M. enterolobii Hsp70
6 有待進(jìn)一步研究之處
參考文獻(xiàn)
縮略表
致謝



本文編號(hào)：3782475