根結線蟲(Meloidogyne spp.)為植物根系內寄生物,可對農作物造成嚴重的危害。在國內已報道30多種根結線蟲中,象耳豆根結線蟲(M. enterolobii Yang and Eisenback,1983)在海南島已普遍分布,廣東省也有發(fā)現(xiàn)。通過海南島瓜類蔬菜、茄果類蔬菜和南藥植物根結線蟲種類鑒定,發(fā)現(xiàn)該種群已進一步擴散,正在顯示出取代南方根結線蟲Meloidogyne incognita,而成為我國熱帶亞熱帶地區(qū)最重要根結線蟲種類的趨勢。近年來對該線蟲的研究備受關注,但對于其功能基因及功能基因組等分子生物學研究報道很少。本研究以該線蟲為材料,在逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)結合cDNA末端快速擴增(RACE)技術的基礎上,克隆得到M. enterolobii的Actin基因和Hsp70基因全長cDNA序列,并對其進行了生物信息學分析以及MeHsp70原核表達分析。主要研究結果如下： (1) MeActin基因全長cDNA序列為1298bp,包含一個全長1125bp的開放閱讀框ORF,編碼375個氨基酸,起始密碼子在82位,終止密碼子在1207位(GenBank登錄號K...

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
1 引言
    1.1 象耳豆根結線蟲研究進展
    1.2 肌動蛋白簡介
    1.3 植物寄生線蟲Hsp70研究進展
        1.3.1 Hsp70家族的分類
        1.3.2 Hsp70的結構及其生物學功能
        1.3.3 植物寄生線蟲Hsp70的研究
        1.3.4 展望
    1.4 研究目的與意義
    1.5 研究的技術路線
2 材料與方法
    2.1 供試線蟲
    2.2 主要試劑與儀器
    2.3 主要試劑及培養(yǎng)基配制
    2.4 象耳豆根結線蟲種群的純化與培養(yǎng)
        2.4.1 象耳豆根結線蟲的鑒定
        2.4.2 象耳豆根結線蟲的培養(yǎng)
        2.4.3 象耳豆根結線蟲J2的獲得
    2.5 總RNA的提取
        2.5.1 TRIzon提取法
        2.5.2 試劑盒提取法(動物組織總RNA提取試劑盒)
    2.6 cDNA的合成
        2.6.1 無RNase的DNase處理
        2.6.2 第一鏈cDNA的合成
    2.7 象耳豆根結線蟲Actin和Hsp70基因核心序列的克隆
        2.7.1 Hsp70簡并引物的設計與合成
        2.7.2 象耳豆根結線蟲Actin基因中間片段的克隆
        2.7.3 象耳豆根結線蟲Hsp70基因中間片段的克隆
        2.7.4 目的片段的回收
        2.7.5 目的片段與T-載體的連接
        2.7.6 質粒轉化
        2.7.7 陽性克隆的鑒定
        2.7.8 重組質粒的測序及分析
    2.8 RACE法獲得象耳豆根結線蟲Actin和Hsp70基因全長cDNA
        2.8.1 3’和5’RACE cDNA第一鏈的合成
        2.8.2 象耳豆根結線蟲Actin和Hsp70基因3'RACE
        2.8.3 象耳豆根結線蟲Actin和Hsp70基因5'RACE
    2.9 象耳豆根結線蟲Actin cDNA和Hsp70 cDNA全長序列的確定
    2.10 生物信息學分析
    2.11 象耳豆根結線蟲Hsp70的原核表達
        2.11.1 象耳豆根結線蟲Hsp70原核表達載體的構建
        2.11.2 Hsp70在BL21(DE3)中的誘導表達及蛋白樣品的制備
        2.11.3 表達產物的SDS-PAGE電泳檢測
    2.12 轉化菌株的高溫脅迫處理
3 結果與分析
    3.1 象耳豆根結線蟲的鑒定
    3.2 RNA的質量分析
    3.3 象耳豆根結線蟲Actin和Hsp70基因的克隆與序列分析
        3.3.1 象耳豆根結線蟲Actin和Hsp70基因中間片段cDNA序列的克隆
        3.3.2 象耳豆根結線蟲Actin和Hsp70基因3'RACE克隆與序列分析
        3.3.3 象耳豆根結線蟲Actin和Hsp70基因5'RACE克隆與序列分析
        3.3.4 象耳豆根結線蟲Actin cDNA和Hsp70 cDNA全長序列的確定
        3.3.5 象耳豆根結線蟲Actin和Hsp70序列分析和同源性比較
        3.3.6 象耳豆根結線蟲Actin和Hsp70進化分析
        3.3.7 象耳豆根結線蟲Hsp70蛋白結構和功能的預測
    3.4 pEASY-E1-MeHsp70、pET30-MeHsp70表達載體的構建及目的蛋白的誘導表達
        3.4.1 重組質粒pEASY-E1-MeHsp70構建結果
        3.4.2 重組質粒pET30-MeHsp70的構建結果
        3.4.3 重組質粒pEASY-E1-MeHsp70、pET30a-MeHsp70轉化受體細菌轉化子的篩選
        3.4.4 Hsp70的表達
    3.5 異源表達Hsp70基因提高大腸桿菌的耐熱力
4 討論
    4.1 M. enterolobii Actin
    4.2 M. enterolobii Hsp70
5 結論
    5.1 M. enterolobii Actin
    5.2 M. enterolobii Hsp70
6 有待進一步研究之處
參考文獻
縮略表
致謝



本文編號：3782475