蚜蟲為農業(yè)重大害蟲之一,屬是刺吸式害蟲,可通過直接刺吸植株汁液及間接傳播病毒病對植物造成嚴重危害。已有報道蚜蟲唾液在蚜蟲-寄主植株互作關系中起到非常重要的作用,如形成口針鞘保護蚜蟲口針以協(xié)助蚜蟲穿刺,幫助蚜蟲消化營養(yǎng)物質,誘導或抑制植株的防御反應,參與病毒傳播等。蚜蟲唾液相關蛋白C002是一種水溶性唾液蛋白,已被證實參與蚜蟲的取食過程,是蚜蟲取食必需蛋白,但其作用機理仍未知。隨著RNAi技術的發(fā)展,在害蟲靶標基因功能的研究中廣泛應用。因此,開展麥蚜C002蛋白基因克隆,并利用RNAi技術進行缺失功能驗證,為解析其在蚜蟲-寄主植物互作中作用機理奠定基礎。 本研究利用RT-PCR及RACE技術擴增麥二叉蚜Schizaphis graminum的唾液相關蛋白C002的cDNA序列全長；運用Real-time PCR研究了該基因的時空表達譜；通過RNAi技術抑制C002基因的表達,利用Real-time PCR技術檢測沉默效率；分析該基因沉默后對麥二叉蚜存活率的影響。取得如下研究結果： 首次克隆了麥二叉蚜唾液相關蛋白C002的cDNA全長序列。根據(jù)已報道的不同種蚜蟲C002蛋白的氨基酸保守區(qū)域...

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 引言
    1.1 蚜蟲唾液及其在蚜蟲-寄主植株互作關系的作用
        1.1.1 凝膠唾液與水溶性唾液
        1.1.2 蚜蟲唾液蛋白C002研究進展
    1.2 實時熒光定量PCR
        1.2.1 實時熒光定量PCR技術原理
        1.2.2 實時熒光定量PCR技術類型
        1.2.3 實時熒光定量PCR技術在昆蟲學中的應用
    1.3 RNA干擾技術研究概況
        1.3.1 RNAi的分子機制
        1.3.2 昆蟲dsRNA的內吸機制研究
        1.3.3 昆蟲RNAi效率影響因素
        1.3.4 昆蟲RNAi技術的應用前景
    1.4 本研究的目的與意義
第二章 麥二叉蚜唾液蛋白C002的基因克隆
    2.1 材料
        2.1.1 供試昆蟲
        2.1.2 培養(yǎng)基配制
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 儀器設備
    2.2 方法
        2.2.1 技術路線
        2.2.2 總RNA的提取
        2.2.3 第一條cDNA鏈的合成
        2.2.4 擴增麥二叉蚜C002基因的引物
        2.2.5 RT-PCR反應體系
        2.2.6 C002 5’-RACE
        2.2.7 C002 3’-RACE
        2.2.8 PCR產物的膠回收純化
        2.2.9 連接與轉化
        2.2.10 菌落PCR鑒定陽性克隆
        2.2.11 質粒DNA的小量提取
        2.2.12 序列測定
    2.3 結果與分析
        2.3.1 麥二叉蚜唾液蛋白C002基因特異性片段擴增
        2.3.2 麥二叉蚜唾液蛋白C002 3’5'-RACE結果
        2.3.3 目的基因開放閱讀框(ORF)全長的獲取與驗證
        2.3.4 目的基因氨基酸序列比對結果
        2.3.5 氨基酸性質預測
    2.4 結論與討論
第三章 麥二叉蚜唾液蛋白C002基因的時空表達譜分析
    3.1 材料
        3.1.1 供試昆蟲
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 儀器設備
    3.2 方法
        3.2.1 總RNA的提取
        3.2.2 第一條cDNA鏈的合成
        3.2.3 擴增麥二叉蚜C002片段及內參基因的引物
        3.2.4 RT-PCR反應體系
        3.2.5 PCR產物的膠回收純化
        3.2.6 連接與轉化
        3.2.7 菌落PCR鑒定陽性克隆
        3.2.8 質粒DNA的小量提取
        3.2.9 序列測定
        3.2.10 熒光定量PCR
        3.2.11 標準曲線構建
    3.3 結果與分析
        3.3.1 RNA質量檢測
        3.3.2 引物篩選
        3.3.3 上機檢測引物特異性
        3.3.4 標準曲線的構建
        3.3.5 SgC002在麥二叉蚜不同組織中的相對表達量
        3.3.6 SgC002在麥二叉蚜不同齡期中的相對表達量
        3.3.7 SgC002在麥二叉蚜不同蚜型中的相對表達量
    3.4 結論與討論
第四章 麥二叉蚜唾液蛋白C002的RNA干擾研究
    4.1 材料
        4.1.1 供試昆蟲
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 主要儀器設備
    4.2 方法
        4.2.1 麥二叉蚜人工飼料的配制與飼蚜器的制備
        4.2.2 siRNA的設計與合成
        4.2.3 siRNA的飼喂方法
        4.2.4 半定量PCR檢測沉默效率
        4.2.5 熒光定量PCR檢測沉默效率
        4.2.6 基因沉默后對麥二叉蚜存活率的影響
        4.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
    4.3 結果與分析
        4.3.1 siRNA的穩(wěn)定性檢測
        4.3.2 半定量PCR檢測飼喂siRNA后SgC002相對表達量變化
        4.3.3 熒光定量PCR檢測siRNA沉默效率
        4.3.4 SgC002基因沉默后對麥二叉蚜存活率的影響
    4.4 結論與討論
第五章 結論
參考文獻
致謝
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本文編號：3738694