蚜蟲(chóng)為農(nóng)業(yè)重大害蟲(chóng)之一,屬是刺吸式害蟲(chóng),可通過(guò)直接刺吸植株汁液及間接傳播病毒病對(duì)植物造成嚴(yán)重危害。已有報(bào)道蚜蟲(chóng)唾液在蚜蟲(chóng)-寄主植株互作關(guān)系中起到非常重要的作用,如形成口針鞘保護(hù)蚜蟲(chóng)口針以協(xié)助蚜蟲(chóng)穿刺,幫助蚜蟲(chóng)消化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),誘導(dǎo)或抑制植株的防御反應(yīng),參與病毒傳播等。蚜蟲(chóng)唾液相關(guān)蛋白C002是一種水溶性唾液蛋白,已被證實(shí)參與蚜蟲(chóng)的取食過(guò)程,是蚜蟲(chóng)取食必需蛋白,但其作用機(jī)理仍未知。隨著RNAi技術(shù)的發(fā)展,在害蟲(chóng)靶標(biāo)基因功能的研究中廣泛應(yīng)用。因此,開(kāi)展麥蚜C002蛋白基因克隆,并利用RNAi技術(shù)進(jìn)行缺失功能驗(yàn)證,為解析其在蚜蟲(chóng)-寄主植物互作中作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。 本研究利用RT-PCR及RACE技術(shù)擴(kuò)增麥二叉蚜Schizaphis graminum的唾液相關(guān)蛋白C002的cDNA序列全長(zhǎng)；運(yùn)用Real-time PCR研究了該基因的時(shí)空表達(dá)譜；通過(guò)RNAi技術(shù)抑制C002基因的表達(dá),利用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)沉默效率；分析該基因沉默后對(duì)麥二叉蚜存活率的影響。取得如下研究結(jié)果： 首次克隆了麥二叉蚜唾液相關(guān)蛋白C002的cDNA全長(zhǎng)序列。根據(jù)已報(bào)道的不同種蚜蟲(chóng)C002蛋白的氨基酸保守區(qū)域...

【文章頁(yè)數(shù)】：76 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 引言
    1.1 蚜蟲(chóng)唾液及其在蚜蟲(chóng)-寄主植株互作關(guān)系的作用
        1.1.1 凝膠唾液與水溶性唾液
        1.1.2 蚜蟲(chóng)唾液蛋白C002研究進(jìn)展
    1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
        1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)原理
        1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)類(lèi)型
        1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在昆蟲(chóng)學(xué)中的應(yīng)用
    1.3 RNA干擾技術(shù)研究概況
        1.3.1 RNAi的分子機(jī)制
        1.3.2 昆蟲(chóng)dsRNA的內(nèi)吸機(jī)制研究
        1.3.3 昆蟲(chóng)RNAi效率影響因素
        1.3.4 昆蟲(chóng)RNAi技術(shù)的應(yīng)用前景
    1.4 本研究的目的與意義
第二章 麥二叉蚜唾液蛋白C002的基因克隆
    2.1 材料
        2.1.1 供試?yán)ハx(chóng)
        2.1.2 培養(yǎng)基配制
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 儀器設(shè)備
    2.2 方法
        2.2.1 技術(shù)路線
        2.2.2 總RNA的提取
        2.2.3 第一條cDNA鏈的合成
        2.2.4 擴(kuò)增麥二叉蚜C002基因的引物
        2.2.5 RT-PCR反應(yīng)體系
        2.2.6 C002 5’-RACE
        2.2.7 C002 3’-RACE
        2.2.8 PCR產(chǎn)物的膠回收純化
        2.2.9 連接與轉(zhuǎn)化
        2.2.10 菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆
        2.2.11 質(zhì)粒DNA的小量提取
        2.2.12 序列測(cè)定
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 麥二叉蚜唾液蛋白C002基因特異性片段擴(kuò)增
        2.3.2 麥二叉蚜唾液蛋白C002 3’5'-RACE結(jié)果
        2.3.3 目的基因開(kāi)放閱讀框(ORF)全長(zhǎng)的獲取與驗(yàn)證
        2.3.4 目的基因氨基酸序列比對(duì)結(jié)果
        2.3.5 氨基酸性質(zhì)預(yù)測(cè)
    2.4 結(jié)論與討論
第三章 麥二叉蚜唾液蛋白C002基因的時(shí)空表達(dá)譜分析
    3.1 材料
        3.1.1 供試?yán)ハx(chóng)
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 儀器設(shè)備
    3.2 方法
        3.2.1 總RNA的提取
        3.2.2 第一條cDNA鏈的合成
        3.2.3 擴(kuò)增麥二叉蚜C002片段及內(nèi)參基因的引物
        3.2.4 RT-PCR反應(yīng)體系
        3.2.5 PCR產(chǎn)物的膠回收純化
        3.2.6 連接與轉(zhuǎn)化
        3.2.7 菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆
        3.2.8 質(zhì)粒DNA的小量提取
        3.2.9 序列測(cè)定
        3.2.10 熒光定量PCR
        3.2.11 標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 RNA質(zhì)量檢測(cè)
        3.3.2 引物篩選
        3.3.3 上機(jī)檢測(cè)引物特異性
        3.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建
        3.3.5 SgC002在麥二叉蚜不同組織中的相對(duì)表達(dá)量
        3.3.6 SgC002在麥二叉蚜不同齡期中的相對(duì)表達(dá)量
        3.3.7 SgC002在麥二叉蚜不同蚜型中的相對(duì)表達(dá)量
    3.4 結(jié)論與討論
第四章 麥二叉蚜唾液蛋白C002的RNA干擾研究
    4.1 材料
        4.1.1 供試?yán)ハx(chóng)
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 主要儀器設(shè)備
    4.2 方法
        4.2.1 麥二叉蚜人工飼料的配制與飼蚜器的制備
        4.2.2 siRNA的設(shè)計(jì)與合成
        4.2.3 siRNA的飼喂方法
        4.2.4 半定量PCR檢測(cè)沉默效率
        4.2.5 熒光定量PCR檢測(cè)沉默效率
        4.2.6 基因沉默后對(duì)麥二叉蚜存活率的影響
        4.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 siRNA的穩(wěn)定性檢測(cè)
        4.3.2 半定量PCR檢測(cè)飼喂siRNA后SgC002相對(duì)表達(dá)量變化
        4.3.3 熒光定量PCR檢測(cè)siRNA沉默效率
        4.3.4 SgC002基因沉默后對(duì)麥二叉蚜存活率的影響
    4.4 結(jié)論與討論
第五章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：3738694