RNAi （RNA interference, RNA干擾）是序列特異的基因沉默技術(shù)。RNAi在植物抗病領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用,2007年美國Monsanto公司及中國科學(xué)院研究人員利用RNAi技術(shù)分別獲得了抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米和棉花,為農(nóng)業(yè)害蟲的防控提供了新的思路和途徑。玉米粘蟲是屬于鱗翅目夜蛾科的非常重要的農(nóng)藥害蟲。近幾年,玉米粘蟲在我國華北地區(qū)爆發(fā)成災(zāi),迫切需要探索有效的控制途徑。本實驗中挑選了對粘蟲生長發(fā)育至關(guān)重要的chitinase基因做為候選基因,設(shè)計合成和檢測了抑制chitinase基因的干擾RNA序列。為了達(dá)到RNAi效果,我們設(shè)計了兩個實驗。第一,體外合成針對靶基因的dsRNA,并與人工飼料混勻,飼喂玉米粘蟲。第二,為了檢測植物體內(nèi)表達(dá)的dsRNA所介導(dǎo)的RNAi效應(yīng),本研究將干擾片段克隆到植物病毒載TMV （PJL36）,并將重組載體侵染了本氏煙草。TMV病毒的復(fù)制過程會產(chǎn)生相應(yīng)插入序列對應(yīng)的dsRNA,將其飼喂給玉米粘蟲,以期在玉米粘蟲體內(nèi)產(chǎn)生針對靶基因的RNA干擾效應(yīng)。隨后,本研究通過測定以下指標(biāo)來檢測了上述兩種方法介導(dǎo)的RNAi效應(yīng)。熒光定量PCR結(jié)果表明,chiti... 

【文章頁數(shù)】：60 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
英文縮寫和中英文對照表
第一章 引言
    1.1 RNAi的研究概況
        1.1.1 RNAi的發(fā)現(xiàn)
        1.1.2 RNAi的基本原理
        1.1.3 RNAi過程相關(guān)酶
    1.2 RNAi技術(shù)在植物抗蟲基因工程中的應(yīng)用
        1.2.1 植物抗蟲基因工程的研究
        1.2.2 植物病毒載體在RNAi中的應(yīng)用
    1.3 RNAi在昆蟲研究領(lǐng)域的應(yīng)用
        1.3.1 昆蟲RNAi
        1.3.2 利用RNAi控制農(nóng)業(yè)害蟲
        1.3.3 dsRNA的攝取
        1.3.4 dsRNA飼喂昆蟲
    1.4 研究目的及意義
第二章 實驗材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 植物材料及昆蟲飼養(yǎng)
        2.1.2 病毒載體及昆蟲飼喂實驗
        2.1.3 人工飼料及配制
        2.1.4 引物序列
    2.2 實驗方法
        2.2.1 克隆及鑒定目的基因
        2.2.2 TMV病毒表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2.3 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒
        2.2.4 TMV重組質(zhì)粒侵染本氏煙草
        2.2.5 本氏煙草飼喂玉米粘蟲
        2.2.6 dsRNA合成及玉米粘蟲飼喂實驗
        2.2.7 RT-PCR檢測基因沉默效率
        2.2.8 地高辛標(biāo)記(DIG)的Northern雜交分析
第三章 結(jié)果與分析
    3.1 干擾基因片段的克隆
        3.1.1 靶標(biāo)基因的PCR擴增
        3.1.2 pGM-T重組質(zhì)粒的篩選
        3.1.3 酶切檢測pGM-T重組質(zhì)粒
    3.2 重組病毒表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.2.1 TMV重組質(zhì)粒的篩選
        3.2.2 TMV重組質(zhì)粒的酶切鑒定
    3.3 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子的篩選
        3.3.1 PCR檢測農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子
    3.4 dsRNA的制備和檢測
    3.5 飼喂玉米黏蟲
    3.6 受試玉米黏蟲的體重及死亡率統(tǒng)計
        3.6.1 本氏煙草飼喂后的玉米黏蟲的體重變化
        3.6.2 本氏煙草飼喂后的玉米黏蟲的死亡率統(tǒng)計
        3.6.3 dsRNA飼喂后的玉米黏蟲的體重變化
        3.6.4 dsRNA飼喂后的玉米黏蟲死亡率統(tǒng)計
    3.7 受試玉米黏蟲的表型變化
    3.8 受試?yán)ハx靶標(biāo)基因表達(dá)量的檢測
        3.8.1 chitinase1基因表達(dá)量的變化
        3.8.2 chitinase2基因表達(dá)量的變化
    3.9 受試玉米黏蟲體內(nèi)靶標(biāo)基因?qū)?yīng)的siRNA的檢測
第四章 討論與結(jié)論
    4.1 討論
    4.2 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]植物抗蟲基因工程的研究[J]. 楊俊杰,于惠敏,張海龍.  山東教育學(xué)院學(xué)報. 2008(03)

博士論文
[1]RNAi介導(dǎo)的棉鈴蟲HaHR3基因沉默及轉(zhuǎn)基因植物抗蟲機理研究[D]. 熊葉輝.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2013

碩士論文
[1]斑馬魚chitinase-3基因的功能分析及其在早期胚胎免疫中的作用[D]. 滕子楠.中國海洋大學(xué) 2014



本文編號：3694378