昆蟲病原線蟲（Entomopathogenic nematode）的基因與模式線蟲秀麗隱桿線蟲Caenorhabdits elegans存在很高的同源性。然而,研究寄生線蟲的基因功能僅靠借助C.elegans的研究結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠,尤其是在闡明寄生蟲與宿主之間的共生關(guān)系的機(jī)制方面。因此迫切需要建立昆蟲病原線蟲的功能基因研究技術(shù)。本研究以小卷蛾斯氏線蟲為研究對(duì)象,利用大腸桿菌飼喂的方法對(duì)小卷蛾斯氏線蟲che-11基因進(jìn)行了 RNAI研究,為昆蟲病原線蟲基因功能研究提供了一種新的技術(shù)方法。本研究所取得的主要結(jié)論如下:（1）利用大腸桿菌HT115在90mm直徑培養(yǎng)基上培養(yǎng)線蟲時(shí),線蟲的最佳接種量為500IJ/皿,其接種代線蟲恢復(fù)率為80%以上,培養(yǎng)20d線蟲產(chǎn)量為4037IJ/皿,收獲的侵染期線蟲整齊度為92%以上。在NGM培養(yǎng)基中添加50 mg/L的Amp或0.4mM的IPTG或50 mg/L的Amp+0.4mM的IPTG,對(duì)線蟲的繁殖無影響。（2）本研究通過分析其他線蟲的che-11基因保守區(qū)序列,設(shè)計(jì)簡并引物PCR擴(kuò)增獲得小卷蛾斯氏線蟲che-11基因的同源片段,并將特異片段重組到L444... 

【文章頁數(shù)】：46 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
第一章 前言
    1.1 昆蟲病原線蟲
        1.1.1 昆蟲病原線蟲的生物防治作用
        1.1.2 昆蟲病原線蟲生活史
        1.1.3 昆蟲病原線蟲的致病機(jī)理
        1.1.4 昆蟲病原線蟲及其共生菌的環(huán)境安全性
    1.2 寄生蟲功能基因組學(xué)的研究進(jìn)展
        1.2.1 差異表達(dá)基因的發(fā)現(xiàn)
        1.2.2 寄生蟲的轉(zhuǎn)基因技術(shù)
    1.3 RNAi在線蟲研究中的應(yīng)用
        1.3.1 RNAi的作用機(jī)制
        1.3.2 RNAi在模式線蟲研究中的應(yīng)用
        1.3.3 RNAi在非模式線蟲研究中的應(yīng)用
    1.4 研究思路、內(nèi)容與技術(shù)路線
        1.4.1 研究思路
        1.4.2 技術(shù)路線
第二章 線蟲的大腸桿菌培養(yǎng)法研究
    2.1 材料與方法
        2.1.1 供試菌株、質(zhì)粒及材料
        2.1.2 培養(yǎng)基配制
        2.1.3 飼喂細(xì)菌的培養(yǎng)
        2.1.4 昆蟲病原線蟲的計(jì)數(shù)
        2.1.5 小卷蛾斯氏線蟲的平板培養(yǎng)
        2.1.6 線蟲接種量對(duì)平板培養(yǎng)線蟲發(fā)育繁殖的影響
        2.1.7 細(xì)菌菌株對(duì)平板培養(yǎng)線蟲發(fā)育繁殖的影響
        2.1.8 培養(yǎng)基中抗生素和誘導(dǎo)劑添加對(duì)平板培養(yǎng)線蟲發(fā)育繁殖的影響
        2.1.9 數(shù)據(jù)處理
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 線蟲初始接種量對(duì)接種代線蟲發(fā)育的影響
        2.2.2 線蟲初始接種量對(duì)線蟲繁殖量的影響
        2.2.3 細(xì)菌菌株對(duì)接種代線蟲發(fā)育的影響
        2.2.4 細(xì)菌菌株對(duì)接種代線蟲繁殖量的影響
        2.2.5 添加物對(duì)接種代線蟲發(fā)育的影響
        2.2.6 添加物對(duì)接種代線蟲繁殖量的影響
第三章 che-11基因的RNAi表達(dá)菌株飼喂線蟲法研究
    3.1 材料與方法
        3.1.1 相關(guān)試劑
        3.1.2 線蟲總RNA的制備與純化
        3.1.3 瓊脂糖電泳檢測
        3.1.4 RNA的反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
        3.1.5 cRNA質(zhì)控
        3.1.6 che-11簡并引物設(shè)計(jì)合成
        3.1.7 目標(biāo)基因的特異擴(kuò)增
        3.1.8 目的基因特異片段的膠回收純化
        3.1.9 目的基因特異片段的T載體連接
        3.1.10 CaCl_2法小量制備大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞
        3.1.11 目標(biāo)基因片段的轉(zhuǎn)化
        3.1.12 藍(lán)白斑篩選及菌液PCR檢測
        3.1.13 核酸測序
        3.1.14 線蟲飼喂RNAi誘導(dǎo)載體的構(gòu)建策略
        3.1.15 che-11目的片段的亞克隆
        3.1.16 靶標(biāo)基因干擾載體構(gòu)建
        3.1.17 靶標(biāo)基因RNAI載體質(zhì)粒提取
        3.1.18 靶標(biāo)基因干擾載體轉(zhuǎn)化RNAi表達(dá)菌株
        3.1.19 目標(biāo)基因的RNAi效果驗(yàn)證
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 總RNA的分離
        3.2.2 che-11基因的同源克隆與測序
        3.2.3 靶標(biāo)基因RNAi表達(dá)大腸桿菌菌株的獲得
        3.2.4 干擾效果的驗(yàn)證
第四章 結(jié)論與討論
    4.1 結(jié)論
    4.2 展望
參考文獻(xiàn)
Abstract
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3683114