褐飛虱Nilaparvata lugens （brown planthopper, BPH）是水稻上的重要害蟲之一,在我國南方部分地區(qū)和長江中下游地區(qū)近年來褐飛虱經(jīng)常暴發(fā)成災(zāi),對我國水稻生產(chǎn)和糧食安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。目前,對于褐飛虱的控制以化學(xué)防治為主,然而化學(xué)藥劑導(dǎo)致的環(huán)境污染問題日益嚴(yán)重,因此當(dāng)前害蟲防治的研究熱點集中在尋求環(huán)境友好的防止新途徑。與此同時,RNAi技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于各種生物體基因功能的研究,這一技術(shù)成功地闡明了多種昆蟲的基因功能。利用該技術(shù)分析基因功能的同時,也為農(nóng)業(yè)害蟲的生物防治開辟了RNAi沉默靶標(biāo)基因的新途徑。在RNAi的研究過程中,利用實時熒光定量PCR分析靶標(biāo)基因mRNA水平是檢測基因沉默效果的重要手段,本研究詳細(xì)分析評估了不同實驗條件下（不同發(fā)育時期、不同組織部位、不同地理種群、不同溫度脅迫、不同藥劑處理、不同食物飼喂和饑餓處理）褐飛虱8種常用持家基因actin1（ACT）、muscle actin （MACT）、ribosomal protein S11（RPS11）、ribosomal protein S15e （RPS15）、alpha2-tubu... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省211工程院校教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：128 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1 褐飛虱的研究概況
    2 精氨酸激酶基因的研究
        2.1 磷酸原激酶概述
        2.2 精氨酸激酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)
        2.3 精氨酸激酶的基因拷貝數(shù)及表達(dá)情況
        2.4 精氨酸激酶的進(jìn)化過程
        2.5 精氨酸激酶與抗性的關(guān)系
    3 實時熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選
        3.1 絕對定量分析和相對定量分析
        3.2 篩選內(nèi)參基因
        3.3 數(shù)據(jù)分析方法
    4 昆蟲的RNAi研究進(jìn)展
        4.1 RNAi的作用機制
        4.2 介導(dǎo)雙鏈RNA進(jìn)入昆蟲體內(nèi)的方法
            4.2.1 微量注射法
            4.2.2 浸泡法
            4.2.3 組織培養(yǎng)法
            4.2.4 人工飼料飼喂法
            4.2.5 轉(zhuǎn)基因植物介導(dǎo)法
        4.3 昆蟲RNAi效率的影響因素
            4.3.1 導(dǎo)入方式
            4.3.2 dsRNA濃度
            4.3.3 dsRNA的設(shè)計
        4.4 昆蟲RNAi的可遺傳性
            4.4.1 親本RNAi(partenal RANi)
            4.4.2 可遺傳RNAi(heritable RNAi)
        4.5 RNAi在害蟲防治中的應(yīng)用
    5 本研究的目的和意義
第二章 材料與方法
    1 實驗材料
        1.1 供試?yán)ハx
        1.2 供試水稻
        1.3 菌株和載體
        1.4 主要儀器設(shè)備及耗材
        1.5 實驗試劑
    2 研究方法
        2.1 常用試劑及培養(yǎng)基的配制
        2.2 褐飛虱人工飼料的配制及褐飛虱的人工飼喂方法
        2.3 水稻營養(yǎng)液的配制
        2.4 內(nèi)參基因引物設(shè)計及初步篩選
        2.5 不同試驗條件下的試蟲及其cDNA模板的挑選
            2.5.1 不同發(fā)育時期
            2.5.2 不同組織部位
            2.5.3 不同地理種群
            2.5.4 不同溫度處理
            2.5.5 不同殺蟲劑處理
            2.5.6 不同飼料處理
            2.5.7 饑餓處理
            2.5.8 總RNA的提取和cDNA第一鏈合成
        2.6 內(nèi)參基因穩(wěn)定性的分析方法
            2.6.1 qRT-PCR方法
            2.6.2 數(shù)據(jù)處理和分析方法
        2.7 精氨酸激酶在褐飛虱體內(nèi)的表達(dá)分析
            2.7.1 精氨酸激酶基因表達(dá)譜
            2.7.2 精氨酸激酶酶活性測定
        2.8 褐飛虱精氨酸激酶基因的克隆、5'-RACE和3'-RACE
            2.8.1 引物設(shè)計
            2.8.2 Trizol抽提褐飛虱總RNA
            2.8.3 純化褐飛虱mRNA
            2.8.4 制備褐飛虱Marathon cDNA
            2.8.5 nlak基因的克隆
            2.8.6 nlak基因的5'-RACE和3'-RACE
        2.9 昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)褐飛虱重組精氨酸激酶
            2.9.1 sf21細(xì)胞傳代
            2.9.2 構(gòu)建重組pBavAK8-nlak質(zhì)粒
            2.9.3 重組Ac NPV-N1AK在昆蟲桿狀病毒中表達(dá)
            2.9.4 SDS-PAGE
            2.9.5 Western-Blotting
        2.10 制備dsRNA
            2.10.1 引物設(shè)計
            2.10.2 制備模板
            2.10.3 dsRNA的合成、純化及檢測
        2.11 dsRNA的飼喂
            2.11.1 dsRNA在人工飼料中的穩(wěn)定性
            2.11.2 dsRNA使用濃度的確定
            2.11.3 dsRNA轉(zhuǎn)入褐飛虱體內(nèi)
        2.12 RNAi分析
        2.13 數(shù)據(jù)處理
第三章 結(jié)果與分析
    1 褐飛虱實時熒光定量PCR中內(nèi)參基因的選擇
        1.1 各候選內(nèi)參基因的表達(dá)水平
        1.2 不同發(fā)育時期各內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析
        1.3 不同組織部位各內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析
        1.4 不同地理種群各內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析
        1.5 不同溫度處理下各內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析
        1.6 不同藥劑下各內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析
        1.7 不同食物飼喂時各內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析
        1.8 饑餓處理時各內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析
        1.9 所有樣品內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析
    2 褐飛虱精氨酸激酶基因的克隆及其分子特性研究
        2.1 nlak基因克隆與分析
        2.2 昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)褐飛虱精氨酸激酶重組蛋白
            2.2.1 重組pBavAK8-nlak質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.2.2 重組Ac NPV-N1AK在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中的表達(dá)
        2.3 nlak基因表達(dá)譜分析
            2.3.1 不同發(fā)育時期nlak基因的表達(dá)分析
            2.3.2 不同組織部位nlak基因的表達(dá)分析
            2.3.3 不同地理種群nlak基因的表達(dá)分析
            2.3.4 不同溫度處理下nlak基因的表達(dá)分析
            2.3.5 不同藥劑處理下nlak基因的表達(dá)分析
            2.3.6 不同食物處理下nlak基因的表達(dá)分析
            2.3.7 饑餓處理下nlak基因的表達(dá)分析
            2.3.8 不同發(fā)育時期褐飛虱精氨酸激酶的酶活性測定
            2.3.9 不同組織部位褐飛虱精氨酸激酶的酶活性測定
        2.4 nlak基因RNAi的分析
            2.4.1 dsRNA在人工飼料中的穩(wěn)定性分析
            2.4.2 dsRNA使用濃度的確定
            2.4.3 nlak基因RNAi后對存活率的影響
            2.4.4 nlak基因RNAi后褐飛虱nlak基因表達(dá)量的變化
            2.4.5 nlak基因RNAi后酶活性測定
第四章 總結(jié)與討論
    1 全文總結(jié)
    2 討論
        2.1 褐飛虱內(nèi)參基因篩選的研究
        2.2 褐飛虱nlak基因RNAi的研究
第五章 創(chuàng)新點
參考文獻(xiàn)
附錄 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表文章
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]中國和越南褐飛虱抗藥性研究[J]. 凌炎,黃鳳寬,龍麗萍,鐘勇,尹文兵,黃所生,吳碧球.  應(yīng)用昆蟲學(xué)報. 2011(05)
[2]煙夜蛾精氨酸激酶基因的克隆及mRNA表達(dá)分析[J]. 張元臣,安世恒,李為爭,郭線茹,羅梅浩,原國輝.  昆蟲學(xué)報. 2011(07)
[3]精氨酸激酶蛋白及分子生物學(xué)的研究進(jìn)展[J]. 蘇曉峰,陸國清,程紅梅.  生物技術(shù)通報. 2011(04)
[4]惠州地區(qū)褐飛虱對幾種藥劑的抗藥性監(jiān)測[J]. 劉鳳沂,李惠陵,邱建友,張燕雄,黃麗聰,李華,王國忠,沈晉良.  昆蟲知識. 2010(05)
[5]內(nèi)參基因在實時定量PCR中應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]. 董曉麗,王加啟,卜登攀,張春林,李珊珊,趙國琦.  中國畜牧獸醫(yī). 2009(09)
[6]RNAi技術(shù)在昆蟲功能基因研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 楊中俠,文禮章,吳青君,王少麗,徐寶云,張友軍.  昆蟲學(xué)報. 2008(10)
[7]實時熒光定量PCR技術(shù)綜述[J]. 鄧文星,張映.  生物技術(shù)通報. 2007(05)
[8]基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄分析中內(nèi)參基因的選擇[J]. 張艷君,朱志峰,陸融,徐瓊,石琳熙,簡序,劉俊燕,姚智.  生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展. 2007(05)
[9]家蠶精氨酸激酶基因的克隆、基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析[J]. 王華兵,徐豫松.  中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2006(11)

博士論文
[1]抗蟲水稻對褐飛虱抗性研究及褐飛虱apterousA基因的功能研究[D]. 李潔.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013
[2]對磷酸原激酶家族中精氨酸激酶與肌酸激酶抑制作用的研究[D]. 盛清.浙江大學(xué) 2009
[3]黃曲條跳甲關(guān)鍵功能基因的克隆及利用RNAi技術(shù)控制害蟲[D]. 趙伊英.福建農(nóng)林大學(xué) 2008

碩士論文
[1]小菜蛾精氨酸激酶基因dsRNA在大腸桿菌中的表達(dá)及其效應(yīng)[D]. 徐秀鳳.福建農(nóng)林大學(xué) 2012
[2]精氨酸激酶在棉鈴蟲中的表達(dá)及調(diào)控研究[D]. 蘇曉峰.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2011
[3]煙夜蛾氣味受體基因和精氨酸激酶基因的克隆與表達(dá)分析[D]. 張元臣.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
[4]海參精氨酸激酶的反應(yīng)半胱氨酸巰基的初步研究[D]. 趙峰.清華大學(xué) 2005



本文編號：3626303