植物銹菌病害是危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要病害之一,發(fā)病率高,寄主種類多,經(jīng)濟(jì)損失大。其中甘蔗黑頂柄銹菌和咖啡駝孢銹菌是危害嚴(yán)重,發(fā)生比較普遍的兩類專性寄生病原菌,前者引起甘蔗褐銹病,而后者導(dǎo)致咖啡葉銹病,目前針對這兩種銹菌還沒有非常有效的防治措施,特別是缺乏相關(guān)的病害檢測技術(shù),因此建立上述兩種病菌的快速檢測技術(shù)對于病害監(jiān)測與防控具有十分重要的意義。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法（LAMP）由于具有高特異性、高靈敏性,以及簡便、快速和低成本等特點(diǎn),已在諸多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。為了建立甘蔗褐銹病菌和咖啡葉銹病菌的LAMP檢測技術(shù),本研究進(jìn)行了如下五個方面的研究。首先,通過對銹菌ITS序列進(jìn)行比對分析,獲得甘蔗褐銹病菌和咖啡葉銹病菌的特異性區(qū)域;利用 primer explorer 4.0 軟件（http://primer explorer.jp/ela mp4.0.0）對特異性區(qū)域進(jìn)行LAMP引物組設(shè)計(jì)。進(jìn)一步通過引物組篩選獲得二者最佳引物BRSC4和HVSC2。其次,基于各自最佳引物組,對25 μL LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后甘蔗褐銹病菌LAMP反應(yīng)體系各組份為:0.2 μM F3和B3,1.2... 

【文章來源】：海南大學(xué)海南省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

LAMP擴(kuò)增機(jī)制示意.(Notomietal.,2000)

ＢＲＳＣ２－ＢＲＳＣ５則均能擴(kuò)增出條帶。其中由引物ＢＲＳＣ２、ＢＲＳＣ３、ＢＲＳＣ４和ＢＲＳＣ５??擴(kuò)增反應(yīng)液均呈綠色，但是它們的凝膠檢測結(jié)果表明，其中ＢＲＳＣ４引物其梯狀條帶??較清晰，而其它引物組條帶較為彌散暗淡，效果不好（圖２．５）。故選取引物ＢＲＳＣ４??進(jìn)行后續(xù)操作。圖２．６為引物ＢＲＳＣ４的序列位置設(shè)計(jì)不意圖。??ｍｍ??圖２．５甘蔗褐銹病菌ＬＡＭＰ引物篩選??Ｍ：?ＤＬ２０００標(biāo)準(zhǔn)分子量；１：陰性對照；２：引物ＢＲＳＣ１；?３：引物ＢＲＳＣ２；?４：引物ＢＲＳＣ３；?５：??引物ＢＲＳＣ４；?６：弓丨物ＢＲＳＣ５。Ａ，?ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ顯色圖；Ｂ，瓊脂糖凝膠電泳圖。??Ｆｉｇ．?２．５?Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ?ｏｆ?ＬＡＭＰ?ｐｒｉｍｅｒ?ｆｏｒ?ｓｕｇａｒｃａｎｅ?Ｐｕｃｃｉｎｉａ?ｍｅｌａｎｏｃｅｐｈａｌａ??Ｍ：?ＤＬ?２?０００?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ；?１：?ｄｄＨ２０?ｃｏｎｔｒｏｌ；?２：?Ｐｒｉｍｅｒ?ＢＲＳＣ１；?３：?Ｐｒｉｍｅｒ?ＢＲＳＣ２；?４：?Ｐｒｉｍｅｒ??ＢＲＳＣ３；?５：?Ｐｒｉｍｅｒ?ＢＲＳＣ４；?６：?Ｐｒｉｍｅｒ?ＢＲＳＣ５．?Ａ，?ＬＡＭＰ?ｒｅａｃｔｉｏｎ?ｃａｕｓｉｎｇ?ｃｈａｎｇｅ?ｉｎ?ｃｏｌｏｒ；?Ｂ，?ＬＡＭＰ??ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｅｄ?ｏｎ?２?％?ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ．??１?ＣＡＣＣＴＴＴＴＧＧ?ＴＡＴＴＣＣＡＡＡＡ?ＧＧＴＡＣＡＣＣＴＧ?ＴＴＴＧＡＧＴＧＴＣ?ＡＴＧＡＡＡＡＣＣＴ??＾Ｆ３上游引物??５１?ＣＴＣＡＣＴＡＡＡＡ?ＣＡＡＣＴＴＴＧＴＴ?ＡＴＡＧＴＴＴＴＴＴ?ＴＴＡＧＴ

ＢＲＳＣ２－ＢＲＳＣ５則均能擴(kuò)增出條帶。其中由引物ＢＲＳＣ２、ＢＲＳＣ３、ＢＲＳＣ４和ＢＲＳＣ５??擴(kuò)增反應(yīng)液均呈綠色，但是它們的凝膠檢測結(jié)果表明，其中ＢＲＳＣ４引物其梯狀條帶??較清晰，而其它引物組條帶較為彌散暗淡，效果不好（圖２．５）。故選取引物ＢＲＳＣ４??進(jìn)行后續(xù)操作。圖２．６為引物ＢＲＳＣ４的序列位置設(shè)計(jì)不意圖。??ｍｍ??圖２．５甘蔗褐銹病菌ＬＡＭＰ引物篩選??Ｍ：?ＤＬ２０００標(biāo)準(zhǔn)分子量；１：陰性對照；２：引物ＢＲＳＣ１；?３：引物ＢＲＳＣ２；?４：引物ＢＲＳＣ３；?５：??引物ＢＲＳＣ４；?６：弓丨物ＢＲＳＣ５。Ａ，?ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ顯色圖；Ｂ，瓊脂糖凝膠電泳圖。??Ｆｉｇ．?２．５?Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ?ｏｆ?ＬＡＭＰ?ｐｒｉｍｅｒ?ｆｏｒ?ｓｕｇａｒｃａｎｅ?Ｐｕｃｃｉｎｉａ?ｍｅｌａｎｏｃｅｐｈａｌａ??Ｍ：?ＤＬ?２?０００?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ；?１：?ｄｄＨ２０?ｃｏｎｔｒｏｌ；?２：?Ｐｒｉｍｅｒ?ＢＲＳＣ１；?３：?Ｐｒｉｍｅｒ?ＢＲＳＣ２；?４：?Ｐｒｉｍｅｒ??ＢＲＳＣ３；?５：?Ｐｒｉｍｅｒ?ＢＲＳＣ４；?６：?Ｐｒｉｍｅｒ?ＢＲＳＣ５．?Ａ，?ＬＡＭＰ?ｒｅａｃｔｉｏｎ?ｃａｕｓｉｎｇ?ｃｈａｎｇｅ?ｉｎ?ｃｏｌｏｒ；?Ｂ，?ＬＡＭＰ??ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｅｄ?ｏｎ?２?％?ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ．??１?ＣＡＣＣＴＴＴＴＧＧ?ＴＡＴＴＣＣＡＡＡＡ?ＧＧＴＡＣＡＣＣＴＧ?ＴＴＴＧＡＧＴＧＴＣ?ＡＴＧＡＡＡＡＣＣＴ??＾Ｆ３上游引物??５１?ＣＴＣＡＣＴＡＡＡＡ?ＣＡＡＣＴＴＴＧＴＴ?ＡＴＡＧＴＴＴＴＴＴ?ＴＴＡＧＴ

【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
[1]LAMP與SYBR GREEN I實(shí)時熒光定量PCR方法檢測酸奶中葡糖桿菌的研究[D]. 李月華.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
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本文編號：3598371