球孢白僵菌Beauveria bassiana （以下簡稱白僵菌）具有侵染力強、分布廣以及流行快的特點；同時也具有易于培養(yǎng),不污染環(huán)境等優(yōu)勢。因此,作為重要的昆蟲病原真菌,白僵菌目前已廣泛應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)害蟲生物防治。然而,在實驗室培養(yǎng)和工業(yè)生產(chǎn)過程中,白僵菌也普遍存在著菌體退化問題。白僵菌菌體退化對于其發(fā)酵生產(chǎn)及殺蟲效果有著直接的負面影響。研究表明,DNA甲基化修飾普遍存在于生物生命過程中。它通過調(diào)節(jié)基因表達使生物體在生長發(fā)育過程中產(chǎn)生出不同的性狀。因此,揭示球孢白僵菌在培養(yǎng)過程中菌體退化與其DNA甲基化的關(guān)系,可以為今后進一步研究白僵菌表觀遺傳學(xué)以及DNA甲基化在菌體生長發(fā)育機制中的具體功能提供基礎(chǔ)材料和科學(xué)依據(jù),同時也將為白僵菌的規(guī)�；l(fā)酵與產(chǎn)業(yè)化奠定更加堅實的理論基礎(chǔ)。本研究采用RACE技術(shù)克隆出球孢白僵菌DNA甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因Dim-2全序列,并通過生物信息學(xué)方法,對該蛋白進行了同源序列比對與系統(tǒng)發(fā)育樹分析。同時,本研究還利用Realtime-PCR技術(shù)和HPLC技術(shù)對球孢白僵菌在生長發(fā)育過程中Dim-2基因的轉(zhuǎn)錄表達以及基因組DNA中5-甲基胞嘧啶的含量進行了檢測,分析了球孢... 

【文章來源】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽省

【文章頁數(shù)】：57 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

球抱白僵菌B620d5菌株菌落形態(tài)

４．２球抱白僵菌總民ＮＡ的提純??用ＴＲＩｚｏｌ法提取球抱白僵菌總ＲＮＡ，在１．０％的瓊脂糖凝膠電泳后觀察了大小分??別為２８ＳｒＲＮＡ、ＩＳＳｒＲＮＡ和５Ｓｒ艮ＮＡ的清晰條帶（圖４－２）。各條帶亮度強弱趨勢大??致為２８Ｓ＞１８Ｓ＞Ｗ。用核酸測定儀檢測ＲＮＡ樣品的ＯＤ２６０／ＯＤ２８０數(shù)值位于１．８？２．０??之間。由此可知，提取的總ＲＮＡ質(zhì)量很好，沒有發(fā)生降解，可Ｗ進行下一步實驗。??Ｉ??■??圖４－３球巧白僵菌總ＲＮＡ檢測??Ｆｉｇ．４－３?Ｐｒｏｆｉｌｅ?ｏｆ?ＲＮＡ?ｅｘｔｒａＵｅｄ?行ｏｍ?公．６口抓／打內(nèi)口??４．３球抱白僵菌。／Ｗ－２基因ｃＤＮＡ的３Ｖ５’ＲＡＣＥ末端片段擴增??用ＣＬＯＴＥＣＨ公司的ＳＭＡＲＴ？民ａｃｅ證ＮＡ?Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｋｉｔ試劑構(gòu)建球抱白僵??菌３＇－ＲＡＣＥ庫和５＇－ＲＡＣＥ庫，并通過兩輪ＰＣ民反應(yīng)得到相關(guān)片段（圖４－３）。經(jīng)克??隆轉(zhuǎn)化，挑取陽性克隆進行菌落ＰＣＲ驗證（圖４－４，圖４－５），并進行測序。??Ｍ??４００ｂｐ?—??２００ｂｐ???圖４－４?ＰＣＲ產(chǎn)物的檢測??Ｆｉｇ．４－４?Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ??２３??

┚?＃?鰨?不?潁悖模危列蛄腥?さ鈉唇蛹胺治觶崳?將ＲＡＣＥ克隆得到的球抱白僵菌化Ｗ－２基因３＇端和５’端序列，與ＧｅｎＢａｎｋ中已??知的該基因部分序列進行拼接，最終獲得了全長４０２化Ｐ的ｃＤＮＡ序列（圖４－６）。分析??表明，球抱白僵菌。加－２基因開放式閩讀框由３４２９個核昔酸組成，編碼了?１１４２個氨??基酸。５＇非翻譯區(qū)（５＇－ＵＴＲ）與３＇非翻譯區(qū)（３＇－ＵＴＲ）分別為２８３個核昔酸和３０３??個核昔酸。白僵菌０／Ｗ－２編碼蛋白的分子量１２８ｋＤ，理論等電點６．１３。１１４２個氨基??酸中含強堿氨基酸１２７個（Ｋ，?Ｒ），強酸氨基酸１４３個（Ｄ，Ｅ），疏水氨基酸３６７個??（Ａ，Ｉ，Ｌ，Ｆ，Ｗ，?Ｖ），極性氨基酸３０１個（Ｎ，Ｃ，?Ｑ，?Ｓ，Ｔ，Ｙ），分別占總氨基??酸的?１１．１２％，１２．５２〇／〇，３２．１３〇／〇和?２６．３６％。??數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，球抱白僵菌甲基轉(zhuǎn)移酶基因在密碼子的第Ｓ位堿基的使用概率分??別為Ｃ：２９．５％，Ｔ：２３．８％，Ｇ：２６．３％，Ａ：２０．４％。表明該基因在密碼子的使用上，沒有??顯示出明顯的偏愛性。??４．５球抱白僵菌。／Ｗ－２基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)分析??白僵菌ＤＩＭ－２蛋白結(jié)構(gòu)域分析顯示

【參考文獻】：
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博士論文
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本文編號：3579300