囊泡運(yùn)輸包括胞吞途徑和分泌途徑,是真核生物中普遍存在的特有的蛋白運(yùn)輸方式。作為重要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,Rab家族蛋白在囊泡的形成與轉(zhuǎn)運(yùn)起著重要的調(diào)節(jié)作用。酵母Rab家族蛋白成員之一 Sec4在分泌囊泡從高爾基體到質(zhì)膜融合中起作用,調(diào)節(jié)囊泡分泌蛋白至胞外。在病原真菌與植物相互識(shí)別及其侵染過程中,分泌到胞外的效應(yīng)子,是引致植物病害過程所必須的。因此研究稻瘟病菌中Sec4同源蛋白的功能十分重要。本研究分別通過生物化學(xué)與分子遺傳學(xué),細(xì)胞生物學(xué)及植物病理學(xué)的方法研究了稻瘟病菌MoSec4在生長發(fā)育及致病性中的作用,結(jié)果顯示,MoSec4的缺失導(dǎo)致稻瘟病菌生長速率有所下降,產(chǎn)孢量顯著下降,同時(shí)孢子變長,對細(xì)胞壁敏感劑如剛果紅、SDS、過氧化氫等敏感性增強(qiáng),附著胞膨壓受影響,對感病水稻品種毒力下降;進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),MoSec4缺失突變體顯示出對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ER抑制劑更敏感,分泌至胞外的水解酶如蔗糖酶、淀粉酶、纖維素酶、漆酶等變少,突變體無法激發(fā)具相應(yīng)抗病基因水稻品種Pid3、Pi9及Pib產(chǎn)生HR反應(yīng),ROS的產(chǎn)生減少,防衛(wèi)基因OsPR1a、OsPAL、OsPBZ1在侵染水稻48至72h后表達(dá)量比野生型更高;將細(xì)...

【文章來源】： 福建農(nóng)林大學(xué)福建省

【文章頁數(shù)】：62 頁

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摘要
Abstract
一 引言
    1 真核生物囊泡運(yùn)輸機(jī)制及其調(diào)控因子
        1.1 囊泡運(yùn)輸概況
        1.2 囊泡運(yùn)輸路徑:胞吞途徑和分泌途徑
        1.3 胞吞和分泌途徑相關(guān)的蛋白調(diào)控因子及其作用
            1.3.1 Rab蛋白在囊泡運(yùn)輸中的作用
                1.3.1.1 Rab蛋白
                1.3.1.2 分泌途徑相關(guān)基因Sec4
            1.3.2 粘附因子在囊泡運(yùn)輸中的作用
                1.3.2.1 粘附因子
                1.3.2.2 Sec4下游組件分泌復(fù)合物
            1.3.3 其他蛋白家族在囊泡運(yùn)輸中的作用
                1.3.3.1 包被蛋白復(fù)合物
                1.3.3.2 SNARE蛋白
                1.3.3.3 SM蛋白家族
    2 病原菌與植物互作防御機(jī)制
        2.1 病原菌與植物互作時(shí)的防御機(jī)制PTI和ETI
        2.2 效應(yīng)子及其在植物與病原物互作中的作用
    3 稻瘟病菌及其效應(yīng)子在囊泡運(yùn)輸中的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制
        3.1 稻瘟病的危害和侵染機(jī)制
        3.2 稻瘟病菌效應(yīng)子及其轉(zhuǎn)運(yùn)分泌機(jī)制
        3.3 研究稻瘟病菌Sec4同源基因在效應(yīng)因子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制中作用的意義
二 材料與方法
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 供試菌株
        1.2 供試質(zhì)粒
        1.3 供試植物
        1.4 生化試劑
        1.5 培養(yǎng)基
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 Sec4同源蛋白的獲得和結(jié)構(gòu)域分析
        2.2 融合蛋白AvrPizt-mcherry、BAS4-GFP、Spa2-mcherry、Sec4-GFP構(gòu)建
            2.2.1 供試載體
            2.2.2 融合蛋白的構(gòu)建
            2.2.3 轉(zhuǎn)化子的篩選與驗(yàn)證
                2.2.3.1 PCR反應(yīng)體系
                2.2.3.2 質(zhì)粒提取和稻瘟病菌原生質(zhì)體制備與轉(zhuǎn)化
                2.2.3.3 轉(zhuǎn)化子DNA提取和驗(yàn)證
        2.3 Quantitative RT-PCR分析基因表達(dá)量
            2.3.1 水稻RNA的提取
            2.3.2 RNA的反轉(zhuǎn)錄
            2.3.3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR
        2.4 酶活測定
        2.5 基本表型分析(所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置三次獨(dú)立重復(fù)生物學(xué)重復(fù))
            2.5.1 菌落生長速率測定
            2.5.2 菌絲和菌絲體形態(tài)分析
            2.5.3 稻瘟病菌產(chǎn)孢量統(tǒng)計(jì)
            2.5.4 孢子形態(tài)觀察和隔膜染色
            2.5.5 稻瘟病菌分生孢子梗觀察
            2.5.6 孢子萌發(fā)率、附著胞形成率統(tǒng)計(jì)及附著胞的塌陷情況分析
            2.5.7 ER和細(xì)胞壁敏感性分析
            2.5.8 不同碳源下的生長情況分析
            2.5.9 洋蔥表皮侵染實(shí)驗(yàn)
            2.5.10 致病性分析
            2.5.11 稻瘟病菌葉鞘接種以及DAB染色實(shí)驗(yàn)
            2.5.12 AvrPizt-mcherry、BAS4-GFP、Spa2-mcherry及Sec4-GFP熒光觀察
三 結(jié)果與分析
    1 稻瘟病菌MoSec4獲得和氨基酸系列保守性分析
    2 MoSec4的缺失影響稻瘟病菌生長和孢子形態(tài)建成
        2.1 MoSec4的缺失影響稻瘟病菌生長
        2.2 MoSec4的缺失影響細(xì)胞壁敏感性
        2.3 MoSec4的缺失影響分生孢子的形成
    3 MoSec4的缺失影響稻瘟病菌的毒力
    4 MoSec4的缺失對ER抑制劑更敏感
    5 MoSec4的缺失影響稻瘟病菌胞外酶分泌
    6 MoSec4是稻瘟病菌分泌效應(yīng)蛋白所必須的
    7 MoSec4影響細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)子AvrPiz-t分泌和BIC的形成
    8 MoSec4一定程度上影響了非質(zhì)原效應(yīng)子BSA4的分泌
    9 MoSec4可能通過調(diào)控下游組件在分泌途徑中起作用
    10 MoSec4可能介導(dǎo)內(nèi)膜細(xì)胞器在分泌途徑中起作用
四 小結(jié)與討論
    1 稻瘟病菌中Sec4同源基因存在結(jié)構(gòu)保守性
    2 MoSec4與稻瘟病菌生長發(fā)育相關(guān)
    3 MoSec4參與稻瘟病菌分泌途徑,影響稻瘟病菌毒力
    4 MoSec4介導(dǎo)不同效應(yīng)蛋白分泌,參與不同分泌途徑
五 下一步研究內(nèi)容
攻讀碩士期間發(fā)表的論文
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Rab蛋白的結(jié)構(gòu)、功能與研究展望 [J]. 吳文林,吳穗潔.  臺(tái)灣海峽. 2006(04)

碩士論文
[1]稻瘟病菌中一個(gè)假定的Rab族蛋白R(shí)AB8之功能分析[D]. 劉淑燕.福建農(nóng)林大學(xué). 2008



本文編號：3555610