東方粘蟲Mythimna separatea(Walker)屬鱗翅目,夜蛾科,是禾本科作物的主要害蟲。東方粘蟲中腸上皮細(xì)胞刷狀緣膜囊泡(Brush Border Membrane Vesicles,BBMV)中有一種Ⅴ型H+ATP酶,將ATP水解時(shí)產(chǎn)生的能量形成質(zhì)子梯度來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的pH環(huán)境。近些年越來(lái)越多學(xué)者已經(jīng)將V-ATP酶作為藥物靶標(biāo)來(lái)研究。本研究針對(duì)東方粘蟲中腸BBMV中V-ATP酶A和B亞基進(jìn)行研究,對(duì)東方粘蟲中腸BBMV中V-ATP酶A亞基基因(vatpa)和B亞基基因(vatpb)進(jìn)行了克隆、原核表達(dá)及復(fù)性純化。主要結(jié)果如下:利用Trizol法提取東方粘蟲中的總RNA,通過(guò)反轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)擴(kuò)增,得到cDNA,然后以這條序列為基礎(chǔ),設(shè)計(jì)3’端和5’端特異性引物,再利用快速擴(kuò)增技術(shù)(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)克隆得到東方粘蟲中腸BBMV的3’端和5’端序列,最后通過(guò)拼接得到vatpa的cDNA全長(zhǎng)序列,該核苷酸序列共2180 bp,包含一個(gè)長(zhǎng)1854 bp的開...

【文章來(lái)源】： 西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：56 頁(yè)

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 東方粘蟲研究概述
    1.2 V-ATP酶結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展
        1.2.1 V1部分的亞基
        1.2.2 V0部分的亞基
    1.3 V-ATP酶生物學(xué)功能研究進(jìn)展
    1.4 本研究的目的及意義
    1.5 本研究的設(shè)計(jì)思路
第二章 東方粘蟲中腸vatpa cDNA的克隆
    2.1 材料與方法
        2.1.1 材料
        2.1.2 方法
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 東方粘蟲中腸總RNA的提取和檢測(cè)
        2.2.2 東方粘蟲中腸vatpa中間片段PCR擴(kuò)增和檢測(cè)
        2.2.3 東方粘蟲中腸vatpa 3'RACE擴(kuò)增與檢測(cè)
        2.2.4 東方粘蟲中腸vatpa 5'RACE擴(kuò)增與檢測(cè)
        2.2.5 東方粘蟲中腸vatpa RACE序列驗(yàn)證
        2.2.6 東方粘蟲中腸vatpa cDNA全長(zhǎng)拼接及分析
        2.2.7 東方粘蟲中腸vatpa系統(tǒng)進(jìn)化樹分析和氨基酸序列比對(duì)
第三章 東方粘蟲V-ATP酶A、B亞基原核表達(dá)載體構(gòu)建
    3.1 材料與方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 方法
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 PCR擴(kuò)增東方粘蟲vatpa和vatpb及鑒定
        3.2.2 東方粘蟲vatpa和vatpb的PCR產(chǎn)物回收
        3.2.3 原核表達(dá)載體pET-22b(+)質(zhì)粒的提取與雙酶切檢測(cè)
        3.2.4 原核表達(dá)載體pET-22b(+)的回收
        3.2.5 原核表達(dá)載體pET22b-vatpa及pET22b-vatpb的構(gòu)建與鑒定
第四章 東方粘蟲中腸vatpa和vatpb誘導(dǎo)表達(dá)及復(fù)性純化
    4.1 材料與方法
        4.1.1 材料
        4.1.2 方法
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 東方粘蟲中腸vatpa和vatpb氨基酸序列預(yù)測(cè)目的蛋白的基本參數(shù)
        4.2.2 重組pET22b-vatpa的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE檢測(cè)分析
        4.2.3 重組pET22b-vatpb的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE檢測(cè)分析
        4.2.4 重組pET22b-vatpa及pET22b-vatpb蛋白的復(fù)性及檢測(cè)
        4.2.5 重組pET22b-vatpa及pET22b-vatpb蛋白的Ni柱純化及檢測(cè)
第五章 結(jié)論
第六章 討論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號(hào)：3532503