稻瘟病菌能夠侵染以水稻為主的眾多重要農(nóng)作物,同時也是研究絲狀真菌的生長、發(fā)育和致病性的重要模式生物。作為機體重要分子開關(guān)的Rab GTP酶是Ras超家族的其中一員。在釀酒酵母中有三類Rab5家族蛋白,Ypt51,Ypt52,Ypt53,在胞吞和囊泡融合等方面起重要作用。MoYpt51（MGG₀6241）和MoYpt52(MGG 是稻瘟病菌中與釀酒酵母的Ypt51和Ypt52同源的兩個基因。為了研究這兩個蛋白的功能,我們分別構(gòu)建了 MoYpt51/52的正顯性激活載體（constitutively active,CA）和負(fù)顯性失活載體（dominantly negative,DN）,并把它們分別轉(zhuǎn)入到野生型菌株Guy11中,最終得到突變體Mo Ypt51/52-C4/DN,并對其進(jìn)行了表型分析。所有突變體的生長速率都顯著減慢,完全喪失了產(chǎn)孢能力,用突變體的菌絲塊分別對造傷和正常的大麥、水稻葉片進(jìn)行離體接種,均不致病。Mo Ypt51/52-C4/DN突變體囊泡融合受阻,喪失了頂體結(jié)構(gòu),有性生殖也被阻斷。為了進(jìn)一步分析MoYpt51/52的功能,我們獲得了這兩個基因的... 

【文章來源】：福建農(nóng)林大學(xué)福建省

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１實驗所用質(zhì)粒圖譜??Ｆｉｇ．?１?Ｔｈｅ?ｍａｐｓ?ｏｆ?ｐｌａｓｍｉｄｓ?ｕｓｅｄ?ｉｎ?ｔｈｉｓ?ｓｔｕｄｙ??６??

?福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文???（ＲａｂＳＦｌ－ＳＦ４）。在這些蛋白的Ｃ端還具有明顯的半胱氨酸ｍｏｔｉｆｓ?（通常以??ＣＸＸＸ，ＣＣＸＸ，ＸＣＸＣ，ＸＸＣＣ的形式存在），它們可以被異戊烯化，從而引導(dǎo)??Ｒａｂ蛋白的膜定位。??１?〇ｑ?Ｒａｂ－５Ａ??６６??Ｒａｂ－５Ｂ???ＭｏＹｐｔ５２???ＭｏＹｐｔ５１??９７１?Ｙｐｔ５１???Ｙｐｔ５２??Ｉ?１??０．０５??圖３?Ｒａｂ５的在３個物種中的系統(tǒng)發(fā)育樹??Ｆｉｇ．３?Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ?ｔｒｅｅ?ｏｆ?Ｒａｂ５?ｉｎ?ｔｈｒｅｅ?ｓｐｅｃｉｅｓ??將３個物種Ｒａｂ５蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對，并用ＤＮＡｍａｎ軟件構(gòu)建了的??系統(tǒng)發(fā)育樹（圖２），發(fā)現(xiàn)人類的Ｒａｂ５Ａ和Ｒａｂ５Ｂ的同源性極高，同時稻瘟病菌??的ＭｏＹｐｔ５２和人類的Ｒａｂ５在進(jìn)化上比較接近，稻瘟病菌的ＭｏＹｐｔ５１和酵母的??Ｙｐｔ５１在進(jìn)化上則較為接近。說明稻瘟病菌里面的這兩個Ｒａｂ蛋白在進(jìn)化上處于??不同的階段，ＭｏＹｐｔ５１相對ＭｏＹｐｔ５２來說比較保守。??３．３釀酒酵母Ｙｐｔ５１單倍體敲除突變體的分離??＋?咖?Ｈａｐｌｏｉｄ??Ｙｐｔ５２－ＯＲＦ｜＾＾?，???＾??Ｙｐｔ５１－〇ＲＦ＾?．．ｎ．—??圖４酵母單倍體巧行／敲除突變體的驗證??Ｆｉｇ．４?Ｔｈｅ?ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｈａｐｌｏｉｄ?ｋｎｏｃｋｉｎｇ?ｏｕｔ?ｏｆ?Ｙｐｔ５１?ｉｎ?Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ?ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ??對雙倍體作／５７的單敲突變體（德國ＥＵＲＯＳＣＡＲＦ）進(jìn)行單倍體分離，經(jīng)ＤＮＡ??提取和Ｙｐｔ５１的ＯＲＦ引物驗證，結(jié)果只得到

?福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文???（ｚ／ｒｐ／５／＋ｐＹＥＳ２）在此培養(yǎng)基上均不能生長，這與先前的研究結(jié)果［３３］是一致的。??而未經(jīng)分離的雙倍體｝如５／的單敲突變體在含有ＣＦＷ的ＹＰＤＡ培養(yǎng)基上是可以??生長的（圖５），據(jù)此，說明得到的單倍體敲除突變體是可靠的。??Ｄｉｐｌｏｉｄ?Ｙｐｔ５１??ｙｐｔ５２??ＹＰＤＡ?ＹＰＤＡ＋ＣＦＷ??圖５二倍體｝＞／５７的單敲突變體對ＣＦＷ不敏感??Ｆｉｇ．５?Ｔｈｅ?ｓｉｎｇｌｅ?ｄｅｆｅｃｔ?ｏｆ?ｄｉｐｌｏｉｄ?Ｙｐｔ５１?ｉｓ?ｎｏｔ?ｓｅｎｓｉｂｌｅ?ｔｏ?ＣＦＷ??３．４相關(guān)載體的驗證??３．４．１異源互補載體的驗證??結(jié)合ｐＹＥＳ２上的引物和克隆片段木身的引物，分別驗證從〇沙／５／和Ｍ？）丨Ｗ的??異源互補載體，得到相應(yīng)的擴(kuò)增片段（圖６，?５１ＹＹ＋，５２ＹＹ＋），其大小都比克??？?？??７５０ｂｐ￣７１７ｂｐ??■?６６６ｂｐ??圖６稻瘟病菌０／５異源互補載體的驗證??Ｆｉｇ．６?Ｔｈｅ?ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓｌｙ?ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ?ｖｅｃｔｏｒｓ?ｏｆ?ＭｏＹｐｌ５??隆片段木身長度要稍大（存在載體上的一段核酸片段）。同時用ＢａｍＨ丨和ＥｃｏＲ?Ｉ??進(jìn)行酶切驗證，得到和克隆片段長度相同大小的條帶（圖６，?５１ＹＹＤｉｇｅＳｔｉ〇ｎ，??５２ＹＹＤｉｇｅＳｔｉｏｎ）。測序結(jié)果經(jīng)序列比對，沒有出現(xiàn)錯義突變（她切／５／的異源互??補載體有一個堿基發(fā)生突變，但編碼的氨基酸沒有改變）和移碼情況（圖８Ｇ，??Ｈ）。以上結(jié)果表明Ｍｏ〗和５／和Ａ而｝＾５２的異源可．補載體構(gòu)建成功。??２５??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3410603